肿瘤生物治疗实验室常用实验方法-终稿介绍.pdfVIP

肿瘤生物治疗实验室常用实验方法 肿瘤生物治疗实验室常用实验方法 肿肿瘤瘤生生物物治治疗疗实实验验室室常常用用实实验验方方法法 华西肿瘤生物治疗实验室蛋白质组 林鸿刚 总RNA的提取（Trizol法提取） 总RNA的提取（Trizol法提取） 总总RRNNAA的的提提取取（（TTrriizzooll法法提提取取）） 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA 制备工作。若需暂时储存， 则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA 时，将储 存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻， 以避免RNase 的作用。 1. 提取组织RNA 时，每50～100mg 组织用1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；提 取细胞RNA 时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106 个细胞加1ml Trizol 后，反 复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的Trizol 裂解液转入EP 管中，在室温（15℃～30℃）下放 5 置 分钟； 3. 在上述EP 管中，按照每1ml TRIZOL 加0.2ml 氯仿的量加入氯仿，盖上EP 管盖子，在手中用力震荡15 秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3 分钟后， 12000g 2 8 15 （ ℃～ ℃）离心 分钟； 4. 取上层水相置于新EP 管中，按照每1ml TRIZOL 加0.5ml 异丙醇的量加入异 丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10 分钟, 12000g（2℃～8℃）离心10 分钟； 5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL 加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g （2℃～8℃）离心5 分钟，弃上清； 6. 让沉淀的RNA 在室温下自然干燥； 7. Rnase-free water 溶解R 沉淀。 PCR PCR PPCCRR 实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM ，TaKaRa E TaqTM 和 X PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM 是一般的DNA 聚合酶，保真性较差， 但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E TaqTM 是具有Proof reading X 活性的耐热性DNA 聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR 产物3’ 端附有一个“A” 碱基，如果希望直接将产物克隆到 T-vector 可以用此酶。 PyrobestTM DNA Polymerase 也是具有Proof reading 活性的耐热性DNA 聚合酶， 其特点是保真性极高，扩增得到的PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增 请使用此酶。 1. 按下列组成在PCR 反应管中调制反应液： 1 TaKaRa TaqTM 或TaKaRa E TaqTM 的配方 X Reagent Quantity,for50µlofreaction mixture Reagent Quantity,for50µlofreaction mixture RReeaaggeenntt QQuuaannttiittyy,,ffoorr5500µµllooffrreeaacct