4病理标本基因突变检测的流程和质量控制.pdf

病理标本基因突变检测的 流程及质量控制 北京医院病理科 刘东戈 王征 • 实验室的规范化设臵及其管理 •进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存 和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区( 简称扩增 区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用 不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。 •基因扩增检验实验室质量保证: •(一)标本的采集 •分子病理基因扩增检测的临床标本包括组织和细胞标本，应使用一 次性密闭容器。采样时必须戴一次性手套。 •(二)标本的稳定化处理 •标本应及时用10% 中性福马林固定送至病理科。 •(三)标本的运送 •标本采集后必须尽快送至病理科。通常在运送时，应采用不易破碎 的容器装载标本。用于RNA检测的标本，则必须速冻后，放在干冰 中运送。 •( 四)标本的贮存 •病理组织和细胞学标本可于-70 ℃下长时间贮存。用于DNA测定的 标本经石蜡包埋后可室温保存。用于RNA测定的病理标本-80 ℃或 液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20 ℃即可。用GITC 处 理的RNA标本在室温可保存7 天。 •(五)标本的处理(核酸提取) •标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使 用商品核酸提取试剂提取病理标本中的核酸模板前，应对其进行充 分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑 制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身(如血红素及其 前体或降解产物) 或核酸提取过程中残留的有机溶剂(如酚、氯仿等) ， 这些物质对其后的Taq 酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而 影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理， 再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。 此外，当靶核酸为RNA 时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本 在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA酶的污染。 对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA 降解的证据， 则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指 导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。 •( 六)靶核酸的逆转录(RT)和扩增 •1 、靶RNA的逆转录 •cDNA 合成为逆转录PCR 中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA 为 靶RNA的反向互补链，为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDN A 合成的效率：(1) 逆转录效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有 逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；(2) 用于逆转录 的标本中存在逆转录或Taq 酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等) ； (3)RNA 酶的存在导致RNA的降解。 •2、核酸的扩增 •有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶 核酸中抑制剂存在、Taq 酶失活、退火温度不对、Mg++ 浓度不佳、 患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要， 必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检 查，以避免假阴性结果。 •(七)污染 •在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染(产物 污染) ；天然基因组DNA的污染、试剂污染( 贮存液或工作液) 以及标 本间交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本) 。 临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。 • 由于一旦发生污染后，再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还 很繁琐，所以防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须 停止，直到发现了污染源为止，并且实验结果必须作废。 •1 、测定分析前的污染源 •测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。 •2、测定分析阶段的污染源 •通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合 液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的 任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂(例如牛血清白蛋白， 明胶或矿物油) 、商品酶制剂、消耗品(如反应管，吸头)和实验设备 (如加样器、离心机) 等。 •在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗 品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测 时，非常容易引起污染，因此必须制定标准操作程序(SOP) ，并严 格执行。 •3 、污染的避免 •要避免污染，首先应是预