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腺相关病毒 腺相关病毒操作手册 一、腺相关病毒 （Adeno-AssociatedViralVector，AAV）简介 腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA 病毒。AAV 的基因组约 4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145 个核苷 酸组成的2 个反向末端重复序列(ITR)之间。 基因组中有3 个启动子(P5、P19 和P40) 和2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap，如图1 所示。rep 编码4 个重叠的多功能蛋白，即Rep7 、Rep6 、Rep52 和 Rep40，其中Rep7 与Rep6 参与AAV 的复制与整合，Rep52 和Rep40 具有解螺 旋酶和ATP 酶活性，与Rep7 、Rep6 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的VP1、 VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AAV 病毒整合、复制和装 配中其重要作用。 图1.AAV 基因结构 二、腺相关病毒的优点 1. 安全性高：迄今从未发现野生型AAV 对人体致病，重组AAV 基因组序列上 去除了大部分的野生型AAV 基因组元件，进一步保证了安全性； 2. 免疫原性低：AAV2 的基因组仅4681 个核苷酸，便于用常规的重组DNA技 术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小； 3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞； 4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达； 5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿； （汉恒--AAV包装） 三、重组腺相关病毒载体系统简介 AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV 1 腺相关病毒 无辅助病毒系统 （AAVHelper-FreeSystem）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺 相关病毒。在AAVHelper-FreeSystem 中，生产具有感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺 病毒基因产物（如：E2A，E4 等基因）大部分由pHelper 质粒提供，其余的腺病毒基 因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是HEK293 细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。野生型AAV 基因组由病 毒rep 和cap 基因（分别编码AAV复制和包装相关的基因）及位于两侧的表达和包装 必须的顺式作用元件——反向末端重复序列（InvertedTerminalRepeats，ITRs）组成。 在AAV Helper-Free System中，rep 和cap 基因从病毒载体中被转移到辅助质粒 pAAV-RC 中，AAVITRs 仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下，仅需两端的ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep 和cap 基因的转移后空出 的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。由于不再需要活的辅助病毒， AAVHelper-FreeSystem 提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因 传递系统。 图2.AAVHelper-FreeSystem腺相关病毒系统 三、重组腺相关病毒载体不同血清 2 腺相关病毒 研究发现AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的AAV 载体的主要区别是 衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在 包装腺相关病毒时有 9 中不同的 AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不 同 组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见表 1。 血清型 组织亲和性 AAV1 肌肉，心脏，骨骼肌 （包括心肌，）神经组织 AAV2 中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，