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微生物分子生态学专题讲座 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 变性凝胶梯度电泳 2013年6月 本 节 内容 Ø DGGE的概念 ØDGGE的基本原理 Ø DGGE的主要步骤 Ø DGGE的应用 Ø DGGE的优缺点 一、DGGE的概念 DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis） 是根据DNA在不同浓度的变性剂中解 链行为的不同而导致电泳迁移率发生 变化，从而将片段大小相同而碱基组 成不同的DNA片段分开。 一、DGGE的概念 将特定的双链DNA片段在含有从低 到高的线性变性剂梯度的聚丙烯 酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进 行，DNA片段向高浓度变性剂方向 迁移，当它到达其变性要求的最 低浓度变性剂处，双链DNA形成部 分解链状态，这就导致其迁移速 率变慢，由于这种变性具有序列 特异性，因此DGGE能将同样大小 的DNA片段很理想地分开，是一种 很有用分子标记方法 DGGE技术的发展历程 DGGE 技术是由Fischer 和Lerman 于1979 年最先提出的 用于检测DNA 突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼 脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高, 可以检测到一个 核苷酸水平的差异。 1985 年Muzyers 等首次在DGGE 中使用GC夹板 和异源双 链技术, 使该技术日臻完善。1993 年Muzyers等首次将 DGGE 技术应用于分子微生物学研究领域, 并证实了这种 技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异 方面具有独特的优越性。 p重要文献 ►Myers RM, Fischer S G, Lerman L S, et al . Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC clamp can be det ected by denaturing gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Res , 1985, 13: 3131- 3145 ►Muyzer G, Waal E C, Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes encoding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol , 1993, 59: 695-700 二、DGGE的原理 DGGE 技术检测核酸序列是通过不 同序列的DNA 片段在各自相应的 变性剂浓度下变性，发生空间构 型的变化，导致电泳速度的急剧 下降，最后在其相应的变性剂梯 度位置停滞，经过染色后可以在 凝胶上呈现为分散的条带。 DGGE不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度 梯度的不同,将序列不同的DNA分开。 p 分类 变性剂梯度方向: 垂直DGGE和平行DGGE （1）垂直DGGE，变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验 决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围; （2） 平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用 于解链范围明确的DNA片段的检测 三、DGGE的主要步骤 l样品总DNA 提取及纯化; l样品16S rDNA 片段的PCR 扩增; l预实验( 主要是对扩增出的16S rDNA 片段的解链性质及所 需的化学变性剂浓度范围或温度梯度范围进行分析) ; l制胶; l跑胶、染色 l样品的DGGE分析 三、DGGE的主要步骤 示意图 3.1 DNA提取 微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础。 一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。细 胞