一种二步衍生法同步分析碱基-核苷-有机酸-脂肪酸-氨基酸及糖类代谢产物的方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 *CN102621247A* (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 102621247 A (43)申请公布 日 2012.08.01 (21)申请号 201210114246.2 (22)申请 日 2012.04.18 (71)申请人 王益超 地址 410013 湖南省长沙市长沙高新开发区 鷁巢生物科技有限公司 (72)发明人 王益超 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 马强 (51) Int.C l. G01N 30/02 (2006.01) 权利要求书 2 页 说明书 17 页 附图 1 页 权利要求书2 页 说明书17 页 附图1 页 (54) 发明名称 一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机 酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种二步衍生法同步分析碱 基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物 的方法。该方法是将生物基质样本 (如尿液、血 液、脑脊液) 及组织液等经过一系列超声、离心、 肟化，除脲素、除磷、除硫、除蛋白、氮吹、真空干燥 及三甲基硅烷化衍生等理化方法技术处理后，再 采用气相色谱仪- 质谱联合技术对生物基质样本 进行检测。该方法能同时对生物基质样本进行程 序化处理，一次性检测五大类以上物质400 余种 代谢中间和终末产物。 A 7 4 2 1 2 6 2 0 1 N C CN 102621247 A 权 利 要 求 书 1/2 页 1. 一种二步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方 法，其特征是，具体步骤包括： 1) 取样 ：收集生物基样本； 2) 定量待测样品：对生物基样本进行物理洗脱并收集洗脱液；测定洗脱液中肌酐含 量，确定肌酐浓度，取相当于2.50 μmoL/ μL 肌酐浓度的洗脱液25 μL-300 μL 作为待测样 品，备用 ； 3) 肟化处理过程，即直接在上述待测样品中加入2.5 μl-90 μl 肟化试剂，调PH 值至 7-14，密封样品并加热至45℃-70℃条件下，充分反应15min-90min，使待测样品完成肟化 反应，得肟化反应后的样品；所述肟化试剂的浓度为0.01μg/ μl-50 μg/ μl，肟化试剂选 自盐酸羟胺水溶液、甲氧基胺盐- 吡啶溶液或乙氧基胺盐- 吡啶溶液； 4) 预处理：对肟化后的待测样品进行除磷及除硫、除脲素、除蛋白、超声和离心处理后 取离心液b，然后干燥，得残留物，即为预处理后的样品；所述干燥是指氮气吹干或真空浓 缩干燥或先真空浓缩干燥再氮气吹干 ；所述除磷及除硫是指在待测样品中加入0.08mol/ L-1.2mol/L 的钡剂水溶液 10 μL-200 μL，震荡5-30 分钟后离心，收集离心液a ；所述 u u 除脲素是指在上述离心液a 中加入含脲素酶3 / μL-6 / μL 的水溶液30 μL-260 μL，于 25℃-42℃温度下水浴10-45 分钟 ；所述除蛋白是指再加入相对于离心液a 1.5-6.7 倍体 积的溶剂300 μL-2000 μL 震荡5-30 分钟，其中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮酸、乙晴或吡 啶； 5) 一次三甲基硅烷化衍生反应 ：在预处理后的样品中加入25 μL-300 μL 的三甲基硅 烷化衍生剂，置干燥加热器上在3℃-200℃温度下衍生10min-120min，得硅烷化衍生反应 后的检测样品；