人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备.pptVIP

一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征 二、实验原理 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。 当在培养基中加入植物凝集素（PHA）时，小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。 经过短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察. 这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。 三、实验用品 1.材料：人体外周血 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸管、恒温水浴锅等 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μg∕ml）、植物凝集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。 四、实验方法 1.外周血细胞培养 （1）采血：无菌，肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素0.2ml,润湿针筒,推出多余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。） （2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）, 接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀， 37℃培养箱中培养68小时。 （20滴） （3）秋水仙素处理：0.05～0.4μg∕ml培养基，轻摇混匀后，继续培养至72小时 。 实验方法 2.染色体的制备 （1）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以1500转/分离心10分钟，弃去上清液，留下沉淀物约0.3ml。 （2）低渗处理：加入预温37℃的低渗液至8ml，用吸管轻吹打混匀，置于37℃恒温水浴锅中低渗20分钟 。低渗后吹打要轻,以防细胞破裂. （3）预固定：缓缓加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管轻吹打混匀。以1500转/分离心10分钟，弃上清液， 留约0.3ml沉淀物。 （4）固定：加入新鲜固定液至8ml，吸管吹打混匀，室温固定20分钟， 1500转/分离心10min，去上清液。依上述方法再重复固定1次。 实验方法 （5）制备细胞悬液： 预留0.2～0.3ml固定液 ，加2滴新配固定液制成细胞悬液 （6）滴片： 吸取细胞悬液，滴2～3滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火焰上过火后，空气干燥。(每组3张，只染1张） （7）染色： Giemsa染液染色10分钟，自来水轻冲洗，晾干，镜检。 五、实验结果 在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分裂相，再转至油镜观察。 六、实验注意事项 1.接种的血样愈新鲜愈好 。 2.培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外。培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。 3.培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。 4.制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开,可将固定时间延长。 每组上交2张未经染色染色体标本。 * * 细胞与遗传学教研室 人类染色体标本的制作 PHA 37℃ 68h 秋水仙素 至72 h 外周血淋巴细胞 G0期或G1期