第三章 目的基因分离与克隆.pdf

第三章第三章 目的基因分离与克隆目的基因分离与克隆 主讲主讲：：胡银岗胡银岗 西北农林科技大学农学院植物科学系西北农林科技大学农学院植物科学系 本章主要内容本章主要内容 第一节第一节 功能蛋白组策略功能蛋白组策略 第二节第二节 基因组策略基因组策略 第三节第三节 功能基因组策略功能基因组策略 第一节第一节 功能蛋白组策略功能蛋白组策略 一一、、功能蛋白组技术概述功能蛋白组技术概述 技术路线技术路线 从基因的功能信息出发从基因的功能信息出发，，以生物以生物 某性状的基本生化过程及生化特某性状的基本生化过程及生化特 征为依据征为依据，，寻找产生生化特征的寻找产生生化特征的 蛋白质基础蛋白质基础，，然后分离纯化功能然后分离纯化功能 蛋白蛋白。。 一一、、功能蛋白组技术概述功能蛋白组技术概述  获得了纯化的功能蛋白获得了纯化的功能蛋白 （（即目的蛋白即目的蛋白））后后  以目的蛋白的一级结构为依据以目的蛋白的一级结构为依据，，进行多肽链氨基进行多肽链氨基 酸序列分析酸序列分析，，获得起码的氨基酸序列信息后获得起码的氨基酸序列信息后，，合合 成成PCRPCR 引物引物、、通过通过PCRPCR扩增分离此目的蛋白基因扩增分离此目的蛋白基因，， 或者合成寡核苷酸探针或者合成寡核苷酸探针、、通过核酸分子杂交从基通过核酸分子杂交从基 因文库中分离此目的蛋白基因因文库中分离此目的蛋白基因。。 用纯化的目的蛋白为抗原用纯化的目的蛋白为抗原，，制备高特异性抗体制备高特异性抗体，， 利用抗体探针通过免疫反应从表达型基因文库中利用抗体探针通过免疫反应从表达型基因文库中 分离此目的蛋白基因分离此目的蛋白基因。。 一一、、功能蛋白组技术概述功能蛋白组技术概述 该方法的特点该方法的特点 从基因的功能信息着手去获得基因的结从基因的功能信息着手去获得基因的结 构信息构信息，，即从蛋白质功能到基因序列即从蛋白质功能到基因序列。。 该方法的关键该方法的关键 确定并制备出高纯度的蛋白质确定并制备出高纯度的蛋白质。。 二二、、蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术  （（一一））双向电泳原理双向电泳原理  双向电泳是由两个单向电泳组合而成双向电泳是由两个单向电泳组合而成，，在第一在第一 向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二 向电泳向电泳。。双向电泳分离原理与组成它的两个单双向电泳分离原理与组成它的两个单 向电泳的分离原理基本相同向电泳的分离原理基本相同，，其分离效果与组其分离效果与组 成双向电泳的两个单向电泳的分离依据有关成双向电泳的两个单向电泳的分离依据有关。。 二二、、蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术  目前常用的几种单向电泳目前常用的几种单向电泳：： ①①PAGEPAGE ：：依据电荷多少及分子大小依据电荷多少及分子大小。。 ②②SDSSDSPAGE ：：仅按分子大小分离仅按分子大小分离。。在在 凝胶及缓冲液中加入阴离子表面活性剂凝胶及缓冲液中加入阴离子表面活性剂 SDSSDS及及ββ--巯基乙醇巯基乙醇，，将蛋白质拆分成亚将蛋白质拆分成亚 基并与基并与SDSSDS结合结合，，使各组分间原有的电使各组分间原有的电 荷差异被消除荷差异被消除。。 二二、、蛋白质双向电泳技术蛋白质双向电泳技术 ③③PGPGPAGE （（孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳）） 蛋白质在电场作用下沿凝胶浓度逐渐增高蛋白质在电场作用下沿凝胶浓度逐渐增高、、 孔径逐渐减少的方向泳动孔径逐渐减少的方向泳动，，电泳初期各组分电泳初期各组分 迁移速度取决于电荷多少及分子大小迁移速度取决于电荷多少及分子大小。。