第8章(4学时)色谱(层析)分离.ppt

亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接 与配基连接，偶联前需要先活化，活化的方法 主要有： 溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳 酸盐； 高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺 环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联； 甲苯磺酰氯法： 双功能试剂法: 二乙烯砜 ①不溶于水，但高度亲水； ②惰性物质，非特异性吸附少； ③具有相当量的化学基团可供活化； ④理化性质稳定； ⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速； ⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过； ⑦能抵抗微生物和醇的作用。 配基浓度： 配基浓度高有利； 空间位阻： 加入“手臂链”以降低空间位阻的影响； 配基与载体的结合位点 ：就蛋白质等大分子作为配基时，与载体连接的键越少越好； 载体孔径：孔道大小； 微环境：载体或“手臂链”的极性、电性； 制备过程： 1、载体的选择；2、载体的活化；3、配基的连接。 理想载体的特性： 1、不溶性； 2、渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通过； 3、高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状； 4、最低的吸附力； 5、较好的化学稳定性； 6、抗微生物和酶的侵蚀； 7、亲水性； 8、具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。 （一）琼脂糖；（二）硅胶；（三）合成高分子。 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性 是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析 介质：滤纸 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹 将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 优点： 设备简单、操作方便 快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析） 可以大量制备 七、薄层色谱法 一、色谱分离的规模 色谱分析： 10mg； 半 制 备： 10-50mg； 制 备： 1.0-10g； 工业生产： 20g/d。 二、色谱分离方法的选择 1、目的产物的分子结构，物理化学特性，分子量的大小； 2、分子结构，理化特性，大小与目的产物相近的杂质的成分和含量。 3、目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。 第三节 生物工业中的色谱分离 * 一、概念 色谱分离（Chromatographic Resolution，CR）根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法。 色谱分离也称为色层分离或层析分离，在分析检测中则常称为色谱分析。它是一种物理或物理化学分离的分离方法。是一种物理方法。用于定性鉴别、纯度检查、含量测定。 互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。 若各组分对固定相的亲和力大小不同，则各组分的移动速率就不同，从而使各组分在色谱柱内分层而得以分离，这就是色谱分离的基础。 第一节 概 述 二、色谱分离的基本原理： 利用多组分混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中；当多组分混合物随流动相流动时、由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。 其中固定的称为固定相；流过固定相的称为流动相。 洗脱剂——作为流动相的液体。 洗脱液-----洗脱时从柱中流出的溶液（Eluate） 展开（Development）——在色谱操作中，加入洗脱剂（展开剂）而使各组分分层的操作。 载体（支持剂）——分配色谱中，通常采用一种多孔的固体（如硅胶、纤维素、淀粉、硅藻土等）吸附着一种溶剂构成固定相。这种固体本身原分离物不起什么作用，仅起一个支持作用。 色谱（Chromatography）——展开后各组分的分布情况。 层析又称色谱或色层分离。属高度纯化技术。 三、色谱分离中的概念 分配系数——当一个被分离的混合物在流动相的携带下通过固定相时，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律。 分配系数：组分在固定相和流动相之间的分配平衡时的浓度之比。 容量因子：又称质量分配系数，即达到分配平衡后，组分在固定相和流动相中的质量之比。 (1)分离效率高： 色谱分离的效率是