利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)基因.pdfVIP

高技术通讯 年 月 第 卷 第 期 2006 12 16 12 利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的 烯醇式丙酮莽草酰 磷酸合酶（ ）基因! 5- -3- EPSPS ! 陆 伟 梁爱敏 孟秀萍 顿宝庆 金 丹 穆文超 林 敏 （中国农业科学院生物技术研究所 北京 100081） 摘 要 为探索利用宏基因组文库筛选草甘膦不敏感的 烯醇式丙酮莽草酰 磷酸合 5- -3- 酶（ ）基因，直接从土壤中提取细菌 ，构建草甘膦污染土壤细菌宏基因组文库， EPSPS DNA 并利用 合酶缺失突变株 筛选到 个能互补 合酶功能的克隆，其中两个 EPSP ER2799 4 EPSP 克隆的转化子能够在含5mmoI/ L 草甘膦的MOPS 培养基上生长。测序结果表明它们均含 有完整的 合酶编码基因， 核苷酸长度为 ，编码 个氨基酸， EPSP GT-1aroA 1335bp 445 GT-4aroA 核苷酸长度为 1350bp ，编码450 个氨基酸。利用 PCR 方法将两个基因克隆到原核表达载 体 上后，可以使宿主细胞 （ ）在含 草甘膦的 培养基中良 pET28a BL21 DE3 100mmoI/ L MOPS 好生长。上述结果表明，利用宏基因组文库筛选方法可以得到高抗草甘膦的EPSPS 基因。 关键词 宏基因组，烯醇式丙酮莽草酰 磷酸合酶（ ），草甘膦 5- -3- EPSPS 一些基因侧翼序列的获得也将为我们深入了解基因 0 引 言 所处的基因组环境以及生物的系统发育情况提供帮 烯醇式丙酮莽草酰 磷酸合酶（ 助。宏基因组学研究有两种方案，一个是基于功能 5- -3- 5-enoIpyruvyI ， ）（ ） 分析，另一个是基于序列分析。功能分析首先是通 shikimate-3-phosphate synthase EPSPS EC2 . 5 . 1 . 19 是莽草酸途径的第六位酶，是植物、微生物生物合成 过表达性状来鉴定克隆，而后通过序列或生化分析 芳香族化合物的关键酶，也是草甘膦除草剂作用的 来进一步鉴定。现已通过功能筛选宏基因组的方法 ［ ］ 靶酶 1-2 。由于草甘膦是目前世界上商品化最成功 获得了许多新的和已知的抗生素的基因，如一种抗 ［ ］ ［ ］ ［ ］ 生素抗性基 因 13 14 15 的除草剂 Ro