10 过氧化氢酶米氏常数及测定.pptVIP

* 过氧化氢酶米氏常数的测定 河南科技大学医学院 生物化学与分子生物学教研室 【目的】 【目的】 掌握米氏方程及其意义。 掌握过氧化氢酶米氏常数测定的原理、方法和步骤。 【原理】1. 米氏方程 【原理】 米氏方程：当环境温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应速度v 与底物浓度[S]的关系符合米氏方程。 v = ──── Vmax[S] Km +[S] Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 20 40 60 80 底物浓度 [S] Vm 2 Km 初速率 v Vm 动力学曲线 Km值：可通过对米氏方程作图(V~[S]图)求出。在数值上等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度值。单位是mol/L(或mmol/L)。 当v = ── 时， Km = [S] Vm 2 以不同的底物浓度[S]为横坐标，[S]/v为纵坐标，将各点连成一直线，并向纵轴方向延长，此延长线在横轴上的截距即为–Km值。 2. 汉斯方程 2. 汉斯方程 v = ──── Vmax[S] Km +[S] 在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用很大的[S]，也只能得到趋近于Vm的反应速度，难以达到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。为得到准确的Km值，可以把米氏方程转化为 y = ax + b 的直线方程，然后用图解法求出Km值。本实验采用汉斯作图法(Hanes Plot)求Km值。将米氏方程两边取倒数再乘以[S]即为汉斯方程： (汉斯方程式) ── = ── . [S] + ── 1 Vm [S] v Km Vm 方程式两边取倒数再乘以[S] 汉斯方程作图 ── [S] v 1 斜率 = ── Vm 0 [S] Km ── Vm –Km 3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理 本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其Km值和Vm值。 2H2O2 2H2O + O2 过氧化氢酶 2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O 过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定； 通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度v； 通过汉斯作图法可求出过氧化氢酶的Km值和Vm值。 说明： KMnO4既是氧化剂，又是指示剂； Mn2+是滴定反应的催化剂。 3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理 操作1. 肝匀浆制备 【操作】 1. 肝匀浆制备 将小白鼠处死，立即取出肝脏，去除胆囊及结缔组织，用0.45％的盐水洗净。 称取1g肝组织加1ml 0.45%盐水放入匀浆器，研磨成匀浆。取上述匀浆，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至1:10。 取1:10的匀浆液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释定容至50ml(1:500)。 取干燥的100ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。 试剂 (ml) 1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶 0.04mol/L H2O2 25 20 15 10 5 H2O 0 5 10 15 20 放入37℃水浴5分钟 肝匀浆液1:500 1 1 1 1 1 分别加入，准确记时10分钟 10％H2SO4 5 5 5 5 5 0.02mol/L KMnO4滴定 记录0.02mol/L KMnO4用量 2. 反应速度测定 2. 反应速度测定 说明：① 试剂加量要准确； 每个三角瓶可分别保温，但要准确计时。 10％H2SO4液可事先准备好，到时直接倾入。 KMnO4用量记录精确度：0.01 13.38 9.96 6.77 3.84 1.43 3. 计算① 计算各管底物浓度 试剂 (ml) 1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶 0.04mol/L H2O2 25 20 15 10 5 H2O 0 5 10 15 20 放入37℃水浴5分钟 肝匀浆液1:500 1 1 1 1 1 分别加入，准确记时10分钟 10％H2SO4 5 5 5 5 5 0.02mol/L KMnO4滴定 记录0.02mol/L KMnO4用量 13.38 9.96 6.77 3.84 1.43 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L) 3. 计算 ① 按下式计算各管底物浓度(mmol/L)填入下表 H2O2 浓度(mmol/L) × 加入H2O2的体积(ml) 26ml(反应液总体积) [S] (mmol/L) = 38.462 30.769 20.377 15.