第三章 酶及提取与分离纯化.pptVIP

Chapter 3 酶的提取与分离纯化 Section 1 细胞破碎 一、机械破碎法 1、研磨法 2、捣碎法 3、匀浆法 二、物理破碎法 1、渗透压破碎法 2、冻融破碎法 3、超声波破碎法 三、化学破碎法 常用的化学试剂有： 1、表面活性剂：如十二烷基硫酸钠、土温（Tween）、特里顿（Triton）等。 2、有机试剂：如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 3、螯和剂：如乙二胺四乙酸等。 四、酶促破碎法 1、外加酶处理 2、自溶法 Section 2 酶的提取 一、酶提取的方法： 1、盐溶液提取：盐的浓度一般控制在0.02～0.5 mol／L。 2、酸溶液提取：胰蛋白酶可用0.12 mol／L的硫酸溶液提取。 3、碱溶液提取：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11～12.5的碱溶 液提取。 4、有机溶剂提取：如 90%苯酚等。 二、影响酶提取的主要因素： 1、温度 2、pH值 3、提取液的体积 4、添加保护剂 5、溶解度 6、扩散速度 Section 3 沉淀分离 一、盐析沉淀法 二、复合沉淀法：常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。 三、等电点沉淀法 四、有机溶剂沉淀法 五、热处理沉淀法 Section 4 层析分离 一、吸附层析：常用吸附剂包括：硅胶、活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖等。 二、离子交换层析 ：①装柱；②上柱；③洗脱与收集；④再生 三、凝胶层析：凝胶层析又称为凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析等 。 四、亲和层析 五、高效液相层析（HPLC） 六、分配层析 1、纸上层析 2、薄层层析 Section 5 电泳分离 一、纸电泳 二、薄层电泳：常用的支持体有淀粉、纤维素、硅胶、琼脂等 。 三、薄膜电泳 四、凝胶电泳 1、聚丙烯酰胺凝胶的制备 2、聚丙烯酰胺凝胶的分类 ①连续凝胶电泳 ②不连续凝胶电泳 ③梯度凝胶电泳 ④SDS-凝胶电泳 五、等电点聚胶电泳 1、两性电解质载体 2、稳定pH梯度的形成 3、支持pH梯度的介质 ①梯度溶液 ②凝胶 4、操作过程 ①pH梯度支持介质的制备 ②电泳 ③分离组分的检测 Section 6 离心分离 一、离心机的选择 1、常速离心机：最大转速在8000 r／min以内 。 2、高速离心机：最大转速为(1～2.5)×104 r／min 。 3、超速离心机：最大转速达(2．5～12)x 104 r／min 。 二、离心方法的选用 1、差速离心 2、密度梯度离心 3、等密度梯度离心 三、离心条件的确定 1、离心力 2、离心时间 3、温度和pH值 Section 7 过滤与膜分离 一、非膜过滤 1、粗滤：直径大于2 μm的大颗粒 。 2、微滤：直径为0.2～2μm物质颗粒 二、膜分离技术 1、加压膜分离 2、电场膜分裂 3、扩散膜分离 Section 8 萃取分离 一、有机溶剂萃取 二、双水相萃取 1、双水相的形成 2、影响物质分配平衡的因素 三、超临界萃取 四、反胶束萃取 Section 9 结晶 一、盐析结晶法 二、有机溶剂结晶法 三、透析平衡结晶法 四、等电点结晶法 Section 10 浓缩与干燥 一、浓缩 二、干燥 1、真空干燥 2、冷冻干燥 3、喷雾干燥 4、气流干燥 5、吸附干燥 * *