生化学合同讲义（2002年6月12日）.PPT

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ヒト培養細胞でもPHQはAneuploidyを引き起こす 70 60 50 40 30 20 10 0 Proportion of chromosome numbers (％) Aneuploidy (%): 43 73 67 56 57 57 1day 2day 3day 4day 5day day after addition of PHQ ≦40 41 42 43 ≧47 46 45 44 Chromosome numbers PHQ16hr処理 ↓ Wash ↓ 通常の培地で 数日培養 ↓ 染色体観察 HCT116 : 染色体数 主に45本 No treated DNA損傷を作らないPHQでもAneuploidyを誘発 　　-- 非標的仮説 180 150 120 90 60 30 0 YPD 2 mM PHQ 15 ?g/ml Noc PHQは，酵母の細胞周期をG2-M期で停止する . . YPD 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 100 80 60 40 20 0 2 mM PHQ % cells % cells Minutes after release from G1 A B Minutes after release from G1 G1-S G2-meta Ana G2-meta G1-S Ana PHQ 処理すると酵母の形態異常 (elongated bud)が観察される YPD 0.1% MMS 15 ?g/ml Nocodazole 2 mM PHQ 拡大図 Budの形態形成が不十分な状態で周期の進行が止まっている。 Mophogenesis checkpoint -- G2/M境界でdelay。 　　　正しい状態を確認してMPFを活性化してM期に進む。 酵母swe1(wee1 homolog)欠損株ではelongated bud形成は無い。Swe1欠損株ではG2/M境界delayも無い。 MPF = mitosis promoting factor = CycB + Cdk1 (Cdc28) Swe1 (Wee1)，Cdc25によるG2/M境界checkpoint Cdc25 Swe1 G2/M 境界 CDK1(Cdc28) /Cyclin B P P P CDK1(Cdc28) /Cyclin B P G2期 prophase G2/M境界では，Swe1はMPFをリン酸化することで，周期の進行を遅らせ，Cdc25 phosphataseは脱リン酸化することで，周期を前に進める。 PHQはSwe1 (Wee1)を安定化するので，MPFを不活性型に保ちelongated bud形成を促す。 PHQはSwe1を安定化する Time (min) 2 mM PHQ YPD 0 30 45 60 75 90 105 0 30 45 60 75 90 105 Swe1 Swe1 Loading control Loading control α factorでG1に同調し，release後65分にPHQを加える。 10%SDSで流してwestern blotting PHQはSwe1のリン酸化を抑制して安定化する 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 100 80 60 40 20 0 % cells % cells Mi