通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究-高校化学工程学报.PDF

第 25 卷第 2 期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.2 Vol.25 2011 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr. 2011 文章编号：1003-9015(2011)02-0283-06 通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究 汤晓玲, 于洪巍 (浙江大学 化学工程与生物工程学系, 浙江 杭州 310027) 摘 要：对菌株Rhodobacter sphaeroides 的RSP-2728 酯酶基因进行立体选择性定向进化研究，建立了有效的定向进 化策略, 以及通过扁桃酸甲酯水解反应所产生的酸根离子浓度来监测酶活的高通量筛选方法。利用易错PCR 技术，进 行了三轮突变，获得了突变株A6A5 ，B7F11 和C8G1 ，对映体选择性 (E 值)从3.13 分别提高到5.32，8.77 和 14.01； 提高了 1.7 倍，2.8 倍和4.5 倍。序列分析表明，突变体A6A5 有一个62 位上的氨基酸发生了改变，由原先的天冬酰胺 变成了酪氨酸；突变体B7F11 的 62 位的天冬酰胺变成了酪氨酸， 145 位上的亮氨酸变成了组氨酸；突变体C8G1 的 62 位的天冬酰胺变成了半胱氨酸，145 位的亮氨酸变为组氨酸。利用定向进化策略能够有效地提高酶的立体选择性。 关键词：酯酶； 手性选择性； 定向进化； 易错PCR ； 高通量筛选 中图分类号：Q344.1 文献标识码：A Directed Evolution of Esterase for Advanced Enantioselectivity TANG Xiao-ling, YU Hong-wei (Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China) Abstract: The enantioselecttivity evolution of esterase gene RSP-2728 from Rhodobacter sphaeroides was investigated. An efficient directed evolution strategy and a high-throughput screening method based on the pH sensitivity of the indicator, bromothymol blue, to the acid formation occurring by the hydrolysis of (R, S)-methyl mandelate were established. After three cycles of evolution, three mutants, A6A5, B7F11 and C8G1, were obtained. Compared with the wild-type esterase, the enantioselectivities of the three mutants are improved respectively by 1.7, 2.8 and 4.5 times (from E=3.13 to E=5.32, 8.77 and 14.01). According to the sequence analysis, the mutant A6A5 shows that its amino acid Asn 62 is changed into Ty