补肾排毒合剂对瘦素神经内分泌轴及影响.pptVIP

青岛市中医医院 于俊生 研究的目的和意义 近年来,瘦素（Leptin）、瘦素受体及神经肽Y（NPY）与慢性肾功能衰竭营养不良的关系引起了国内外学者的普遍关注，本实验运用免疫组化方法，观察了补肾排毒合剂对慢性肾衰竭营养不良大鼠Leptin及NPY代谢的影响，旨在探讨补肾排毒合剂治疗慢性肾衰竭营养不良的机理。 研 究 方 法 实 验 试 剂 SABC免疫组化试剂盒 瘦素兔抗人多克隆抗体、瘦素受体兔抗人多克隆抗体（Ob-Ra、Ob-Rb通用），NPY兔抗人多克隆抗体（由博士德生物工程有限公司提供） 实 验 药 品 补肾排毒合剂：由柴胡、黄芩、太子参、生地、大黄、六月雪等药物经水煎熬汁、浓缩而成。 生药含量为2.71 g/ml。由青岛市中医医院制剂室提供。 实 验 动 物 Wistar大鼠60只，雌雄各30只，体重240-280g，由青岛市动物研究所提供。于室温23℃，用标准大鼠饲料分笼喂养，自由饮水。 相同条件喂养1周后随机分为3组：正常对照组（Ⅰ组）15例、慢性肾功能衰竭组（Ⅱ组）22例、慢性肾功能衰竭灌胃组（Ⅲ组）23例。 建 立 动 物 模 型 正常对照组行假手术。 慢性肾衰组：采用两步部分肾切除法，首先梯形切去左肾两极，四周后行右肾全切。 慢性肾衰灌胃组：两步部分肾切除法同肾衰组，术后六周模型成熟开始予补肾排毒合剂灌胃，持续6周。 标 本 收 集 与 病 理 切 片 三组大鼠均于术后12周行脱颈椎处死，取头背部“丁”字型切开皮肤，去掉颅骨，取出整个脑组织，沿矢状面切开，保存。刨开腹腔，取出脂肪组织和左肾组织。 取出组织用10%甲醛固定；清水洗涤，逐级酒精脱水；然后浸蜡，石蜡包埋，制作3μm厚的连续切片。 免 疫 组 化（SABC法） 58℃烤片过夜，梯度乙醇脱蜡至水。 滴加3%H2O2，湿盒内室温放置20min，单蒸水洗。 滴加复合消化液，37℃放置1小时，0.01MPBS洗。 滴加血清封闭液，置于湿盒内，室温放置20min，甩去多余液体。 滴加适当稀释的一抗，置于湿盒内，4℃过夜。0.01MPBS。 滴加生物素化羊抗兔IgG，置于湿盒中，37℃放置20min。 滴加试剂SABC，37℃，20min，0.01MPBS洗次。 DAB显色，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。 结 果 判 定 每组切片随机选取5个区域，每个区域包含100个同类细胞，计量阳性细胞，取平均数作为每张切片的阳性细胞数。 统 计 学 方 法 计量资料结果表示为均数±标准差，先采用方差齐性检验，再用两两t检验，用Excel统计软件处理，p0.05差异有统计学意义。 结 果 Leptin在脂肪组织的表达 Ob-R在肾脏的表达 Ob-R在下丘脑的表达 NPY在下丘脑的表达 讨 论 瘦素与瘦素--神经内分泌轴 Leptin主要在脂肪和胎盘组织合成，是由167个氨基酸组成的一种分泌型蛋白质。Leptin通过其受体作用于不同组织，发挥生物学效应，受体中作用明确而且最重要的是长型受体（Rb）和短型受体（Ra）。肾脏是清除Leptin的重要器官。 瘦素-神经内分泌轴：Leptin与Ra结合通过血脑屏障，在下丘脑与Rb结合，通过双向激活激酶（JAK）或信号传导和转录激活蛋白（STAT）途径进行信号传导，影响神经肽Y(NPY)等多种神经内分泌激素的分泌，调节食欲及机体能量消耗，改变营养状态。 瘦素--神经内分泌轴与CRF营养不良 实验结果显示CRF大鼠Leptin-神经内分泌轴存在明显异常。 脂肪组织Leptin表达增高，肾脏Ob-R表达降低， 使Leptin的排出减少，造成高瘦素血症。中枢Ob-R活性增强，Leptin通过血脑屏障向下丘脑转运的量增加。相对较多的Leptin进入下丘脑，通过表达增强的Rb，抑制了NPY的分泌。大鼠食物摄入减少，体重降低，进而逐渐出现营养不良。 补肾排毒合剂对瘦素 --神经内分泌轴的影响 用药组Leptin在脂肪组织较肾衰组表达略有减少。肾组织中Ob-R表达较肾衰组增强。脑中Ob-R的表达强度较肾衰组减弱，NPY的表达增强。 补肾排毒合剂使肾脏对leptin的降解排出增多。同时调整机体细胞代谢，改善胃动力，饮食增加，反馈性抑制leptin受体活性。随着脑中Ob-R的表达强度减弱，进入脑组织leptin的量及其对NPY的抑制作用减轻，NPY的合成分泌增加，使食欲增强，蛋白、脂质合成增加，从而改善CRF大鼠的营养状态。 * * 补肾排毒合剂对慢性肾衰竭大鼠 瘦素—神经内分泌轴的影响 0.080 0.028 49.45±13.60 22 Ⅲ组 0.002 61.70±2