hxj血清清球蛋白分离新.ppt

何肖娟 hxj50701@163.com 生物化学与分子生物学实验教学中心 内 容 实验目的 掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 了解柱层析技术 实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 1. 粗提（盐析法） 由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。 调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 2. 脱盐（凝胶层析） 盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。 脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。 凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 3.纯化（离子交换层析） 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离 4.纯度鉴定（电泳） 三、实验材料 人血清 葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱 饱和硫酸铵溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl2溶液 电泳仪、电泳槽 四、实验过程 盐析（粗分离） 葡聚糖凝胶层析（脱盐） DEAE纤维素离子交换层析（纯化） 醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 五、注意事项 所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。 使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。 上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。 洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。 切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。 葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉! 醋酸纤维素薄膜电泳原理 血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 醋酸纤维素薄膜电泳 1. 点样(粗面) 2. 电泳 3. 染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。 思考题 1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵? 2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白? 3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么? 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 实验预期结果 * 生物化学与分子生物学实验教学中心 * 血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 实验目的 1 实验原理 2 实验材料 3 实验过程 4 5 注意事项 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法 气相层析 液相层析 吸附层析 其他性质 亲和层析 特异结合部位 离子交换层析★ 等电聚焦 电泳★ 电荷 降低介电常数 调整离子强度★ 调整pH 溶解度 离心 凝胶层析★ 透析、超滤 分子质量 常用的纯化方法 蛋白质的理化性质 12~20 6.2~12 4~9 2~5 57~67 含量（％） 15.6~30 9~15 30 20 6.9 相对分子量（×104） 6.85~7.3 5.12 5.06 5.06 4.88 等电点 ? ? ?2 ?1 球 蛋 白 血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量 清蛋白 A 血清清蛋白 球蛋白 半饱和硫酸铵 清蛋白不沉淀，上清 球蛋白沉淀，蒸馏水溶解 凝胶层析分离示意图 凝胶层析分离化合物示意图 R-SO3-H+ + Pr+ R-SO3-Pr+ + H+ 阳离子交换 阴离子交换 R-N+R3OH- + Pr - R-N+R3Pr - + OH- 0.06mol/LNH4AcpH6.5 DEAE带正电荷 清蛋白pI 4.9，带负电荷多 a、b球蛋白pI 5.0～5.2， 带负电荷少 a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附 0.02mol/LNH4AcpH6.5 DEAE带正电荷 清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5 ，带负