分子克隆总.ppt

浪淘沙 生物工程专业核心课程 基因工程概论 2.1 用于基因克隆的载体 动物病毒载体 (1)具有动物病毒的复制起始位点 (2)具有在动物细胞中能表达的选择标记 (3)具有大肠杆菌质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆 位点 目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(Simian virus 40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病毒(Papilloma virus)；(4)逆转录病毒(Retrovirus); (5) 牛痘(Vaccinia)病毒; (6) 牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） 优点：能携带大片段DNA，约300kb 保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因 2.1 用于基因克隆的载体 5‘粘性末端 3‘粘性末端 平端 同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶 HindIII – HsuI: A / AGCTT 同尾酶：识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同 的末端序列 BglII：A / GATCT BamHI: G / GATCC 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。 5‘→3‘的核酸外切酶活性 待切除的核酸分子必须具有5‘端磷酸基团 核苷酸在被切除之前必须是已经配对的 被切除的核苷酸可以是脱氧的也可以是非脱氧的 四、DNA体外重组操作 3）DNA局部酶切消化 在基因文库构建中具有重要意义 DNA分子中只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物 可以通过缩短酶切消化反应的时间，降低反应的温度，减少酶用量来达到局部消化的目的. 一、用于基因转移的受体（宿主） 二、转化与扩增 一、用于基因转移的受体（宿主） 二、转化和扩增（转与增） 转化子的筛选和鉴定的必要性 转化子筛选和鉴定流程 重要生命科学网站 丁香园 医网琴声 A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 重要生命科学网站 丁香园 医网琴声 cDNA法分离目的基因的基本程序 完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是克隆载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 cDNA法分离目的基因的基本程序 特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等 cDNA法分离目的基因的基本程序 差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能 差异分离程序 多瘤病毒感染的FR3T3细胞 正常的FR3T3细胞 总mRNA 总mRNA cDNA 双链cDNA 单链cDNA 作为探针 提取mRNA 合成cDNA 合成第二链 克隆 提取mRNA mRNA-cDNA杂交 上柱 原位杂交 病毒诱导表达的基因 cDNA克隆 杂交分子被吸附 cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因 2.5 目的基因的克隆与基因文库的构建 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 探针合成 据已知ＤＮＡ序列合成 据已知氨基酸序列合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此