无血清培养基试验总结.docVIP

用无血清培养基制备Vero细胞 狂犬病疫苗的实验研究 1材料 细胞株： Vero 细胞（中国典型培养物保藏中心 CCTCC） 病毒株： CTN-1V株（中国药品生物制品标准化研究中心） 培养基及添加物： Medium 199（Gibco公司） 无血清培养基（Gibco公司 、Hyclone公司） 新生牛血清（兰州民海生物有限公司） 细胞培养容器： T75培养瓶，2L转瓶，10L瓶 仪器设备： 细胞培养恒温室，XDS倒置显微镜，转瓶机，7.5L生物反应器 2方法 2.1 2L转瓶试验方法 2.1.1具体步骤 用T75细胞瓶培养复苏的Vero细胞，按照常规方法传代扩增至一定数量的2L转瓶中，待细胞长至均匀单层后接种病毒，换为不同浓度（分别为100%、50%、25%）的两个厂家的无血清培养基作为维持液，同时以传统培养基（M199+0.2%人血白蛋白）作为对照组，根据病变情况收获病毒液并超滤层析。 2.1.2结果及讨论 2.1.2.1细胞状态比较 均匀的单层细胞接种病毒后,在尚未出现病变时，SFM试验组的细胞，体积略大于人白对照组的细胞，细胞轮廓清晰、饱满，病变的出现亦稍晚于对照组；约3-4天时均有病变产生：细胞面呈网状，有脱落、游离细胞。至5-6天收毒时，SFM试验组的细胞维持较好，未脱落细胞多于对照组，细胞维持时间较对照组长。 人白对照组细胞： Hyclone SFM 试验组细胞： Gibco SFM 试验组细胞： 2.1.2.2滴度比较 2.1.2.2.1 100%SFM(Gibco)作为维持液与2‰人白 M199作为维持液所收获的病毒液相比，滴度结果基本一致；但100%SFM(Hyclone)作为维持液的病毒液滴度稍高于人白对照组。（见表一） 表一 编 号 滴度（lgLD50/ml） A:2‰人白 M199 6.8/7.0 B:100%SFM(Gibco) 7.1/7.2 C:100%SFM(Hyclone) 7.5/7.7 2.1.2.2.2在以不同浓度SFM作为维持液的试验中，两者之间差别不明显。（见表二） 表二 编 号 滴度（lgLD50/ml） A： 2‰人白+M199 8.0/7.9 B: 50%SFM(Gibco)+ 50%M199 7.1/7.3 C: 25%SFM(Gibco) +75% M199 7.2/7.8 D: 50%SFM(Hyclone)+50%M199 7.5/7.2 E: 25%SFM(Hyclone)+75%M199 7.1/7.6 2.1.2.3抗原含量比较 由表三的结果可见，试验组的抗原含量均比人白对照组稍高；而表四中的结果无明显的区别。传统维持液中，人血白蛋白的作用是保护细胞和已经产生的病毒不失去感染性，保持病毒液中抗原含量不降低；而由上述结果可见，不同浓度的SFM均可以很好的支持细胞产生病毒，SFM中的添加成分如结合蛋白和转运蛋白具有一定的保护病毒的能力。 所以从感染性滴度和抗原含量的角度考虑，SFM可以替代传统的含人白维持液。 表三 编 号 抗原含量 A:2‰人白+M199一次液 0.445 B:50%SFM(Gibco)一次液 0.630 C:100%SFM(Hyclone)一次液 0.585 D:2‰人白+M199 二次液 0.163 E:50%SFM(Gibco)二次液 0.254 F:100%SFM(Hyclone)二次液 1.130 表四 编号 抗原含量 滴度（lgLD50/ml） A:2‰人白+M199 一次液 7.44 7.0 B:2‰人白+M199 二次液 8.37 7.1 C:2‰人白+M199 三次液 5.10 6.7 D:2‰人白+M199 合并液 8.86 7.1 E:50%SFM（Hyclone）一次液 6.97 7.1/7.2 F:50%SFM（Hyclone）二次液 8.56 6.7 G:50%SFM（Hyclone）三次液 4.17 7.0 H:50%SFM（Hyclone）合并液 8.43 6.9 2.1.2.4效价比较 对照组和实验组的纯化原液取样检测效价，结果均达到较好水平。（见表五） 表五 编号 第一次效价结果 （IU/ml） 第二次效价结果 （IU/ml） A:2‰人白+M199 6.4 5.8 B:50%SFM(Hyclone) 5.8 5.1 2.1.2.5DNA含量的比较 将人白对照组与SFM试验组的病毒收获液、超滤浓缩液及纯化原液分别取样检测DNA含量，结果显示SFM试验组DNA含量均低于人白对照组。 2.2 7.5L生物反应器的试验方法 2.2.1具体步骤 用T75细胞瓶培养复苏的Vero细胞，