十动物细胞培养技术.ppt

第十二章　动物细胞培养技术 第一节 体外培养动物细胞的生物学特性 一、体外培养物的细胞生物学特点 （一）动物细胞特点 体外培养细胞的生长增殖过程 原代培养期:从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。 传代期：原代培养的细胞一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。 衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min 当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 将动物培养材料分散成细胞悬浮液\过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。 ２） 多孔载体法 多用明胶制成。 优点： 降低血清用量，增加细胞固定性。大的生长空间，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。 多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化培养。 （２） 中空纤维培养系统 最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面贴附生长。 （３）微囊培养系统 微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可自由透过，大分子物质可包裹在其中不能逸出。 微囊化培养是将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，减少了搅拌对细胞产生的剪切力。 细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，滴入氯化钙溶液，再用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液处理，形成半透膜。 思考题 按培养细胞的方式不同，反应器可分为以下三类：? 1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、气升式反应器；? 2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器； 3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、填充床反应器。 （二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类 一、培养细胞的生物学鉴定和细胞系（株）的建立 （一）细胞形态观察 １．肉眼观察培养物颜色及混浊度 ２．倒置显微镜观察细胞生长状态 第三节　培养细胞常规检查和特性鉴定 细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标所做出的曲线。 （二）细胞生长情况 1.细胞生长曲线的测定 （1）细胞计数法 细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，用以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。 ●MTT是二甲基噻唑二苯基四唑溴盐， 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。 ● MTT比色法的原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 ●二甲亚砜能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的蓝紫色产物量成正比。再用酶标仪测定OD值。 (2)MTT比色法 （二） 传代培养 贴壁生长的细胞 消化法传代 直接吹打或用硅胶软刮 悬浮细胞 直接吹打 自然沉降法 传代培养方法 （1） 贴壁细胞的消化传代方法 （2） 悬浮细胞传代方法 直接传代 让悬浮细胞自然沉降 弃掉1/2-1/3上清 用吸管轻轻吹打制备成细胞悬液 分装培养 离心法传代 将培养液转移到离心管中 离心收集细胞 弃去上清 加新的培养液吸管吹打制备成细胞悬液 分装培养 体外培养的细胞源于人或动物的胚胎组织，体内的细胞都是混杂生长，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，混杂的细胞会直接影响实验结果。 （三）细胞纯化 1.自然纯化  自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。 但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。  2.人工纯化 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 （1）酶消化法 酶消化法是比较常用的纯化方法，对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰