单克隆及抗体的制备PPT课件.pptVIP

单克隆抗体的制备 广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇 一、单克隆抗体概念： 每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。 二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程 三、单克隆抗体的基本技术 1.抗原提纯与动物免疫： 抗原纯度高：电泳纯 与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠 2.细胞的选择： A 经过抗原免疫的B细胞（脾细胞）。 B 肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0）。 3.细胞融合： 融合剂：聚乙二醇 (PEG,常用聚合度1000~2000浓度w/v：40%) 细胞比例： 1:2~1:10，常用1:4。 反应时间：2~4min。 4.培养基的选择：HAT培养基。含有三种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T). 5.细胞的DNA合成一般有两条途径： A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与反应。 B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。 6. HAT培养基的选择原理： ⑴ 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。 ⑵ 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。 ⑶ B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降)。 ⑷ 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。 7. 克隆化并扩大培养(单细胞培养称为克隆化)： ⑴有限稀释法:将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔(36%的孔为1个细胞/孔)，可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。 ⑵显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。 ⑶软琼脂平板法：下饲养/上融合C,分层培养后用⑵法 ⑷细胞分选仪法：流式细胞仪分选。 8. 单克隆抗体的制备、纯化： A 体外细胞株扩大培养，取上清液提纯。 B 接种小鼠腹腔，取腹水提纯。 C 纯化按抗体纯化步骤进行。 9. 细胞株冻存和复苏：加小牛血清或1640培养液配成终浓度10%的二甲亚砜(DMSO)冻存液后液氮(-196 ℃ )保存。原则是：慢冻(逐步降温，以每分钟降1℃为宜)，快融(立即浸入37~40 ℃ 水浴)。 10.注意事项： ⑴ 用降植烷(pristane)等油类制剂，反复注入BALB/C小鼠腹强腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞。这种细胞在适宜培养条件下，具有无限繁殖能力，选择本身不会产生Ig (SP2/O和小鼠骨髓瘤653细胞株)的对数期生长细胞作为融合细胞。 ⑵选择缺乏HGPRT或TK的细胞： A 采用毒性药物8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)选育出缺乏HGPRT的细胞(因为缺乏HGPRT+细胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+ 细胞才能存活），培养过程中有个别细胞出现返祖现象，故应定期用15~20ug/ml的 8-AG处理细胞。 B 或利用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BudR)诱发缺乏TK的细胞。一般选育缺乏TK的细胞较困难。 ⑶采用饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一定量的其他活细胞后，常可促进原有细胞的繁殖，这种加入的细胞即称为饲养细胞，可用普通小鼠脾细胞/腹腔细胞/胸腺细胞、大鼠和豚鼠的腹腔细胞，最常用普通小鼠腹腔细胞。 三、单克隆抗体的应用： 1.诊断(检测)试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等 2.治疗： A 移植物受者使用T细胞的McAb，可预防急性排斥反应。 B 供体骨髓在体外经T细胞的McAb处理，可减轻或消除移植物抗宿主反应。 C AIDS治疗 D 肿瘤介入治疗：细胞毒剂(药物)与抗肿瘤抗原的McAb结合后，利用McAb的导向作用，将细胞毒剂(药物)定位于肿瘤细胞，到达直接杀死肿瘤细胞的目的。 * 动物免疫 分离脾细胞 制备骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT培养基选择杂交瘤细胞 阳性孔克隆化并扩大培养 再次克隆 克隆扩大培养 扩大培养收集上清液 动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 ELISA测血清 *