碱性磷及酸酶检测.pptVIP

* 　血清碱性磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠法） * 实验目的 熟悉酶活性检测的意义 熟悉血清ALP活性测定方法(磷酸苯二钠法) 掌握血清ALP活性测定的临床意义 * 实验原理 酶活性：酶催化某一化学反应的能力，常用单位时间内产物的生成量(即酶促反应速度)来表示酶活性大小。 终止测定法(或定时法): 在酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，计算酶促反应的平均速度，得到酶活性值。 连续监测法: 每隔一定时间(2-60s)，连续测定产物量随时间变化的情况，求出酶反应初速度，间接得到酶活性值。该方法适用于自动生化分析仪，成为临床测定酶活性浓度最常用的方法。 * 酶活性检测的影响因素 合适的底物与最适底物浓度，[S][E总] 理想的缓冲液与最适离子强度 合适的辅因子、激活剂浓度 合理的测定时间(?) 最适温度(?) 最适pH (?) * * 碱性磷酸酶ALP (Alkaline phosphatase) ALP几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含量较多，儿童的ALP活性高于成人。 临床测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断. 生理性增加: 儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清ALP活性增高. 病理性增加: (1) 肝胆疾病。阻塞性黄疸、黄疸性肝炎和肝癌等，尤以癌性梗阻最明显。 (2) 各种骨骼疾病。佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等。 病理性降低: 呆小症、磷酸酶过少症等。 * 磷酸苯二钠法 在pH=10条件下，ALP可催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠。苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成醌衍生物，根据红色深浅可测定酶活性的大小。 K3Fe(CN)6 金氏单位(King’s unit): 在37℃条件下，每100 mL血清与底物作用15分钟，产生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位。 * 实验步骤 T S B C 血清 (mL) 0.1 — — — 酚标准液 (mL) — 0.1 — — 蒸馏水 (mL) — — 0.1 — 碳酸盐缓冲液 (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀, 37℃水浴保温5分钟，同时将底物液预热 底物液 (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀, 37℃水浴准确保温15分钟 铁氰化钾溶液 (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 血清 (mL) — — — 0.1 立即混匀，以蒸馏水调零点，在510 nm处读取各管吸光度。 参考值: 成人为3-13个金氏单位，儿童为5-28个金氏单位 计算: * 讨论 1. 分析各个试管的功用？ 2. 分析公式中各个数值的意义？ 3. 讨论实验操作中两个时间的意义以及精确性。 * * * * * * * * * * * * * * * * * *