2017-2018年高中生物 第四章 生物化学与分子生物学技术 第2节 分子生物学技术教案 苏教版选修1.docVIP

第二节　分子生物学技术 1．简述PCR技术的原理及基本操作步骤。(重难点) 2．尝试进行DNA片断的PCR扩增。(难点) P C R 扩 增 的 原 理 和 过 程 1．细胞内DNA复制的条件 原料 4种脱氧核苷酸 模板 2条DNA母链 酶 解旋酶和DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 2.PCR扩增技术 (1)概念：在体外快速扩增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的实验技术，又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。 (2)PCR技术的原理： ①条件：DNA模板、TaqDNA聚合酶、脱氧核苷酸引物、四种脱氧核苷酸。 ②PCR扩增的特点：快速、简便和灵敏。 ③进行PCR的先决条件：待扩增的DNA片段3′端的脱氧核苷酸序列要为已知。 ④引物序列确定的依据是：被扩增区域的3′端边界DNA序列。 3．PCR反应的过程 变性— 退火(复性)— 延伸— [合作探讨] 探讨1：什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？ 提示：所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。 探讨2：为什么PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶？ 提示：因为PCR反应过程中变性和延伸都需要较高的温度，一般的DNA聚合酶在这种温度下会变性失活，只有耐高温的TaqDNA聚合酶在这种温度下可以正常发挥作用。 探讨3：如果某DNA片段经过PCR反应扩增了4个循环，请计算双链中都含引物的DNA分子的数目。 提示：由于DNA复制具有半保留复制的特点，所以含有母链的DNA分子只有两个，其他分子的两条链都含有引物。复制4次共形成24＝16(个)，有14个DNA分子的两条链均含引物。 [思维升华] 1．PCR解旋与复旋的原理：DNA热变性的原理 2．PCR的反应过程 (1)变性：当系统温度上升到90 ℃以上时，双链间的氢键打开，DNA解旋为单链，如图： (2)复性：当系统温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合，如图： (3)延伸：当系统温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A，G，C，T)在DNA聚合酶的作用下，从引物的3′末端开始，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图： 3．PCR扩增的计算 理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。 1．DNA片段的PCR扩增 (1)准备器材 (2)在0.2 mL PCR薄壁离心管中加入5_μL10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2,29_μL双蒸水。 (3)煮沸5_min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/μL加入Taq聚合酶。 (4)扩增DNA片断的反应程序：将离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94_℃的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94 ℃，30 s―→55 ℃，30 s―→72 ℃，1 min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72_℃，1_min。运行反应程序。 2．DNA分子的测定 [合作探讨] 探讨1：如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？ 提示：在PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水都要在使用前进行高压灭菌。 探讨2：为什么要将微量离心管放在离心机上进行离心？ 提示：离心的目的是使反应液集中在离心管底部。 探讨3：PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶、引物等条件，如何通过设置对照实验进行验证？ 提示：在对照组中不加入TaqDNA聚合酶或引物，与实验组形成对照，就可以证明PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶和引物。 [思维升华] 1．PCR实验操作的注意事项 (1)PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。 (2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 (3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。 (4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。 (5) PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。 2．PCR技术的应用 (1)医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。 (2)对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。 (3)法医学用此技术来鉴别罪