掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术原理.PPT

第四章 沉淀分离技术 盐析 有机溶剂沉析 等电点沉析 有机聚合物沉析 其他沉析技术 一、盐析 原理 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。 产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。 （4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长的离心时间。（5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。 （二）应用 有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉析所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除有机溶剂，以免影响样品的生物活性 三、等电点沉析 等电点沉析原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低 实验四 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白 目的要求 原理 材料用具 等 电 点 沉 析 制 备 酪 蛋 白 1、将鲜牛奶30 ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加热40℃左右。并用8层纱布过滤牛奶。 2、量取加热后的牛奶20ml。在搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20ml。用酸度计调pH至4.7。 3、将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min，弃去上清液，得酪蛋白粗制品。 4、用水洗沉淀3次，离心（3500r/min）10min，弃去上清液 等 电 点 沉 析 制 备 酪 蛋 白 5、在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 6、将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。 7、准确称量，计算含量和收率。 含量=酪蛋白g/100mL牛乳 思考 题 实验五 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶 目的要求 原理 材料用具 分 离 将提取液加入1％的硅藻土作助滤剂，然后送入板框压滤机。过滤后得无色透明的果胶稀溶液，滤渣弃去。 浓 缩 将过滤收集的滤液置于真空浓缩装置中，于75℃温度下浓缩，直至浓缩到果胶浓度为4％左右。 沉 析 将浓缩液置于搪瓷桶中，并冷至室温，然后乙醇以喷淋方式加至已浓缩好的果胶溶液中，乙醇含量控制在40％～50％的范围内，不断搅动。这时，果胶聚结成海绵状析出。 分 离 将果胶—乙醇混合物经1～2h静置后，送入板框压滤机过滤。收集滤饼(果胶)，然后用80％乙醇溶液洗涤滤饼1～2次，再用95％的乙醇洗涤1～2次。洗完后压干。 干 燥 将以上滤好的果胶置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果胶纯品。 思考 题 实验六 硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质 目的要求 原理 材料用具 清 蛋 白 与 球 蛋 白 分 离 1、取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中，加PBS 100ml搅拌10min。 2、在搅拌下慢慢滴加200ml pH7.2饱和硫酸铵溶液。 3、加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌20~30min以充分沉淀球蛋白。 4、离心（3500r/min） 20min，弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。 各 种 球 蛋 白 的 分 离 1、用100ml PBS溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至250ml烧杯中搅拌15min。 2、在搅拌下，慢慢滴加25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达20%。 3、离心（3500r/min）20min，沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液 4、上清液在搅拌下