第二单元 免疫组织化学染色sp技术.ppt

免疫组织化学技术的定义;免疫组织化学的应用;实验名称;S-P法原理示意图;免疫组织化学基本实验流程;具体步骤如下： 　1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　2．所有组织均采用微波修复抗原； 　3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育 10min； 　5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；;　7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育 过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 　9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育 15min，甩去多余液体； 　10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自??水充分冲洗，苏木素复染； 　11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 　12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。 ;实验流程中的注意事项;染色前处理 －取材、脱水、浸蜡;染色前处理 －预防脱片;染色前处理 －包埋与切片 ;染色前处理 －切片保存;染色前处理 －脱腊;实验操作中的应用;抗原修复 ;内源性过氧化物酶的灭活 ;血清封闭 ;冲 洗 ;一抗孵育时间及抗体选择;检测及显色系统;显色系统;复 染;实验对照设计;结果分析;3.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。 4.避免人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。