TOP10感受态制作方法.docVIP

TOP 10 感受态细胞制备 SOB培养基成分 每升成分 0.5% (w/v) 酵母提取物 2% (w/v) 胰蛋白胨 10 mM NaCl 2.5 mM KCl 20 mM MgSO4 5 g酵母提取物 20 g胰蛋白胨 0.584 g NaCl 0.186 g KCl 2.4 g MgSO4 备注：可以用10 mM MgCl2 and 10 mM MgSO4代替20 mM MgSO4。 高压前调pH至7.5。放入4℃待用。 CCMB80 buffer 每升成分 10 mM KOAc pH 7.0 (10 ml of a 1M stock/L) 0.98g 80 mM CaCl2.2H2O (11.8 g/L) 11.8g 20 mM MnCl2.4H2O (4.0 g/L) 4.0g 10 mM MgCl2.6H2O (2.0 g/L) 2.0g 10% 甘油 (100 ml/L) 100ml 备注：用0.1N HCl调pH至6.4（pH过高会使锰离子变成二氧化锰沉淀）。 无菌过滤后在4℃保存待用。 轻微的深色沉淀不影响其使用效果。 步骤： 把TOP 10菌种接种至固体LB培养基中37℃过夜培养12 h。 挑取大小适当菌落至含10ml LB液体培养基的50 ml玻璃瓶中，置于37 ℃恒温摇床中过夜培养（摇床速度不可过慢，应让菌与空气、营养充分结合，以190左右为宜）。12 h后观察培养液情况，可适当加长培养时间，但不可过久，因为感受态细菌传代越年轻越好。 吸取50μl菌液至于250 ml 配置好的SOB培养基中，至于37℃恒温摇床中培养。开始时每30 min观察一次，以后每10 min观察一次。当OD600值为0.3时（轻轻摇荡锥形瓶可见轻微云雾状混浊）立即取出把整个液体置于冰盒的冰面以下冷却待用。 将要使用的离心管、buffer在使用前均需置于冰上中降温待用。无菌操作台、移液枪等在实用前均需用紫外消毒、酒精擦拭干净。低温离心机在实验开始时就关闭用以制冷。在进行其他操作时也应保持迅速，防止菌液温度过高。 将冷却的SOB菌液倒入一只离心管中（如为单数则需用等量水配平），在4℃下3000g/min离心10 min。 小心弃上清液，用1 ml 移液枪洗去离心管壁上的残夜。 用80 ml CCMB 80 buffer冲洗，小心用移液枪反复吹，小心摇动，不可过于剧烈以免损伤细胞（过程中要将离心管经常置于冰上中以防止温度过高）。 在冰上中放置20 min。 在4℃离心机中3000 g/min 离心10 min。 弃上清液，用1 ml移液枪吸干净离心管内液体。加入2ml CCMB 80 buffer后小心将细菌吹起、摇匀。 将离心管在冰上中放置20 min。 将EP管放入冰上（没过管身大半）中待管冷却后100 μl/管分装。标记后于-80℃冰箱中待用。 备注： 1.感受态细胞制备时所用的玻璃及塑料器皿都应好好清洗。清洁剂会对感受态的制备和转化造成影响。