实验 动物细胞培养基础实验技术.doc

实验 动物细胞培养基础实验技术 ——器械的清洗与消毒 实验目的： 学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。 实验用品： 1．仪器和用品：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22μm/0.45μm微孔滤膜。 2．试剂：75%酒精、5%HCl、1‰新洁尔灭、重铬酸钾。 实验内容： 1．准备培养用血清瓶（PBS、培养基，约10套，包括20、50ml）、培养瓶（50个）、玻璃滴管（若干）、离心管（10ml）、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。 2．分别包装上述物品，其中血清瓶和瓶盖分别包装，玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、 EP管分别置于饭盒中。 3．将上述物品置于高压灭菌锅中进行消毒灭菌。 4．实验室准备。 实验步骤 （一） 清洗 1．玻璃器皿的清洗 浸泡 刷洗 浸酸 冲洗 （1）. 新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡数小时，然后用铬酸浸泡过夜，最后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。 （2）. 用过之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜，最后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。 此外，玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸，培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸，高温灭菌的时候要拧上瓶盖，留有一定的缝隙，灭菌后盖紧。瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住，用绳子扎紧 2．塑料器皿的清洗 自来水充分浸泡 冲洗 2%NaOH浸泡过夜 蒸馏水漂洗3次 2%-5%盐酸浸泡30min 自来水冲洗 晾干 紫外线照射30min 3．胶塞等橡胶类的清洗 自来水冲洗 2%NaOH 煮沸15min 自来水冲洗 蒸馏水煮沸10min 自来水冲洗5次以上 2%-5%HCl煮沸15min 晾干 晾干后高压灭菌 4．金属器械的清洗 新购置的器械 用过的器械 （二）包 装 分为局部包装和全包装。 为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。 按照不同类别进行包装。 （三）消毒灭菌 主要包括物理法和化学法。 物理法：热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。 化学法：应用化学制品进行消毒灭菌。 （四）无菌室和操作野消毒 无菌室内每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1-2次。实验前，将实验器材放入超净台内，打开超净台紫外灯，同时启动超净台风机，40min后消毒完毕，关闭紫外线灯。这样，超净台内空气被净化，超净台面构成相对无菌的环境。 或无菌室：每周用75%酒精擦洗后紫外灭菌。 实验 培养基的配制及细胞培养的条件 一、 1温度条件（37 ＋0.5） 2 pH条件 （7.2-7.4） 3气体条件 4水的质量（三蒸） 5渗透压 6营养条件 7无菌条件℃ 二、?培养基的分类 1平衡盐液 2天然培养基（小牛血清、胚胎液） 3合成培养基（化学成分清楚） 三、?RPMI1640培养基的配制 1、RPMI1640 10 g 2、丙酮酸钠 0.11 g 3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g 4、NaHCO3 2 g 5、三蒸水 1000 mL 四、?过滤出菌 ??? 仪器：不锈钢正压滤器 ??? 材料：纤维素微孔虑膜 （0.22 mm 孔径） 装好后消毒 五、?完全培养基的配制 RPMI 1640 培养液 85 mL 小牛血清 10 mL 谷氨酰氨 1 mL 抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL 实验动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞） 1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞； 2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。 二、实验原理： 小鼠骨髓效力细胞株（NSI，SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养，以为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。 三、实验材料： SP2/0细胞（或杂交瘤细胞） CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴管、消毒用套筒（玻璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。 四、实验步骤： 1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5×104/毫升，置37℃5%CO2培养箱中培养。 2、培养48小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。 3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲，这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。 4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升），而且