Candida parapsilosis（R）-羰基还原酶表达及高效不对称转化苯乙二醇的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 立体选择性羰基还原酶具有高度的化学、区域和立体选择性，常用于催化不对称氧 化还原反应，制备具有光学活性的手性醇等化合物，是一种优良的生物催化剂。近平滑 假丝酵母（Candida parapsilosis ）CCTCC M203011(R)-羰基还原酶 （RCR ）催化 2-羟基 苯乙酮和(R)-苯乙二醇 （(R)-PED ）之间的可逆反应，(S)-羰基还原酶 （SCR ）催化 2-羟 基苯乙酮，生成(S)-苯乙二醇 （(S)-PED ）。为了增强立体选择性羰基还原酶的催化性能， 提高其不对称转化反应效率，本研究构建了 RCR 的大肠杆菌外分泌表达系统，通过改 善重组细胞的通透性，加速目标酶的外分泌和空间折叠，提高了胞外酶的比活力及其生 物转化(R)-PED 的效率。首次构建了 RCR 在 C. parapsilosis 中的原位表达体系，通过优 化生物转化条件，大幅度提高了 RCR 的酶活力及生物转化功能，研究了原位表达重组 酶的酶学性质，具体内容如下： （1）构建了RCR 的大肠杆菌外分泌表达系统。重组酶在细胞周质空间和胞外的比 活分别为 0.72 U/mg 和 0.26 U/mg 。通过添加温和化学渗透剂甘氨酸改善细胞壁的通透 性，促进了重组酶从周质空间分泌到胞外，胞外重组酶的比活力提高至 1.10 U/mg 。以 胞外的粗酶液为催化剂，不对称转化 2-羟基苯乙酮，产物(R)-PED 的光学纯度为 93.9%， 产率为 88.1%，反应时间为 8 h。 （2 ）构建了RCR 于 C. parapsilosis 原位表达质粒 pCP 。通过钓取诺尔丝菌素抗性 基因和 目标基因的启动子和终止子，诺尔丝菌素抗性基因，以及合适的同源臂序列，构 建原位表达质粒 pCP 。该质粒整合到 C. parapsilosis 基因组时敲除了 URA3 基因，使宿 主细胞表现为尿嘧啶营养缺陷型。该表达质粒不仅具有诺尔丝菌素抗性和 5-氟-乳清酸 抗性的正筛选子，还具有尿嘧啶营养缺陷型的负筛选子，大大提高了阳性克隆的筛选效 率。pCP 质粒可用于酶在 C. parapsilosis 的原位表达，有利于重组酶的正确折叠和后修 饰，提高酶的催化功能。 （3 ）通过将 RCR 基因克隆于质粒 pCP ，实现了该酶在 C. parapsilosis 中的高效原 位表达，重组酶在还原反应和氧化反应中的比活力分别为 0.74 U/mg 和 0.15 U/mg 。重 组酶催化还原 2-羟基苯乙酮的最适反应 pH 值为 6.5，在 pH 5.5-8.0 条件下放置 48 h 后， 酶活力仍能保持 80% 以上；最适反应温度为35℃，40 ℃保温 1 h，剩余酶活力不足 80%； 重组酶催化氧化(R)-PED 的最适反应pH 值为 5.0，在pH 4.5-6.0 范围内较稳定；最适反 应温度为 30℃，40 ℃保温 1 h，剩余酶活力低于 80%。以粗酶液为催化剂，不对称还原 2-羟基苯乙酮，产物光学纯度和产率分别高达 99.9%和 99.6%，反应时间仅为2 h ，与大 肠杆菌胞内重组酶相比，反应时间缩短了 4.0 倍。 （4 ）以重组 C. parapsilosis 为催化剂，不对称氧化(R)-PED 反应的最适 pH 和温度 分别为 5.0 和 30℃，产物(S)-PED 的光学纯度和产率分别为 91.8%和 92.2%，反应时间 I 摘 要 为 20 h 。不对称转化2-羟基苯乙酮反应时，在起始 12 h 内还原反应占优势，最适pH 和 温度为 6.5 和 30℃。而 12 h-50 h 时，产物(S)-PED 的光学纯度和产率分别为 94.4%和 95.9% 。 关键词：(R)-羰基还原酶；近平滑假丝酵母；外分泌表达；原位表达；不对称转化 II Abstract