Pleurotus ferulae发酵产漆酶的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 木质素是一种芳香族高分子化合物，与纤维素、半纤维素结合在一起。木质素的存 在不仅使纤维素的利用受到限制，而且还带来了环境问题。木质素酶系主要包括三种酶： 木质素过氧化物酶(lignin peroxidase，简称LiP) 、锰过氧化物酶(mangnase peroxidase，简 称MnP)和漆酶(laccase，简称Lac) 。其中漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛分布于植 物、昆虫和真菌中，其中白腐真菌漆酶研究的最为广泛。漆酶作为一种生物催化剂，在 环境保护和工业生产方面倍受关注，尤其在食品行业、纸浆生物漂白、工业废水处理、 染料脱色、环境污染物质的降解等方面有很大的作用效果。因此，漆酶有其必要的研究 价值，也具有非常大的应用潜力，成为当今研究用酶法保护环境的热点。 本文采用单因素实验法，研究了多种培养液对阿魏蘑Pleurotus ferulae JM30X 液态 发酵产漆酶的影响。P.feru lae JM30X 摇瓶发酵优化后的培养基为：葡萄糖20 g/L，玉米 粉10 g/L，麸皮10 g/L，1 mmol/L 的K SO , 初始pH 为9.0 。500 mL 的三角瓶装液量为 2 4 150 mL，25 ℃，120 r/min。在此条件下，最优的酶活可以达到6832.86 U/L。P. ferulae JM30X 产漆酶经培养基优化后，酶活显著提高，与优化前相比，提高了6.09 倍。 P.ferulae JM30X 菌体形态与漆酶产量之间的关系的研究，结果显示，玻璃珠的添 加可改变发酵过程中菌体形态，漆酶产量在球状菌体条件下高于丝状、絮状菌丝：直径 分布在0.2-0.4 mm 范围的菌球对漆酶的合成具有明显的促进作用；适合的葡萄糖、玉米 粉和麸皮添加量，对直径在0.2-0.4 mm 范围的菌球形成具有重要影响。此外，添加惰性 载体同样可以控制菌球的直径分布，但对漆酶的合成无促进作用。 P.ferulae JM30X 液体发酵后产的漆酶，经过硫酸铵沉淀、Mono Q 5/50 GL 强阴离 子交换层析和SuperdexTM 75 10/300 GL 凝胶过滤层析三步纯化步骤，得到纯化后的阿魏 蘑漆酶，纯化倍数为 4.85 倍，回收率为 26.91% 。纯化后的漆酶经 SDS和 Native电泳得漆酶的表观分子量为66 kDa 。 纯化后的漆酶在50 mmol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲液中，底物为ABTS 时的最适反应 温度为50℃-70℃，最适反应pH 为3.0 。P.ferulae JM30X 漆酶有高的热稳定性，50℃时 t1/2=7.59 h 。阿魏蘑漆酶在酸性pH 条件下比较稳定，在碱性pH 条件下，漆酶迅速失活。 四种抑制剂中，只有1.0 mmol/L 的乙二胺四乙酸(EDTA)对漆酶酶活的抑制作用为50%， 1.0 mmol/L 的叠氮化钠(NaN ) 、二硫苏糖醇(DTT)和苯甲基磺酰氟(PMSF)对漆酶是完全 3 抑制。纯化后的漆酶能被某些金属离子促进，但随着浓度的升高，对酶活的促进作用减 小，当达到一定浓度时就会对酶活有抑制作用，而 Fe2+ 、Fe3+在任何浓度下对漆酶酶活 都完全抑制。P.ferulae JM30X 漆酶的最适底物是ABTS ，对ABTS 的米氏常数(k )和催 m 化效率(k /k )值分别为0.193 mmol/L 和2.73×106 (mmol/L•S)-1 。 cat m P.ferulae JM30X 漆酶是一个新的侧耳属漆酶。目前对P.fer ulae JM30X 液态发酵产 漆酶还没有报道。此外由于P. ferulae JM30X 漆酶有较好的热性，具有潜在的工业潜力 和生物技术功能。 I 摘 要 关键词：阿魏蘑；漆酶；优化；形态；纯化；酶学性质。