人胰岛素前体在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达.pdfVIP

摘 要 胰岛素是人体内唯一能降低血糖的激素，也是唯一能够同时具有促进糖原、脂肪和蛋白质合成的激 素。其作用的机理属于受体酪氨酸激酶机制。胰岛素前体的一级结构是由B-C-A三个肽段连接成的一条 肽链，胰岛素是由胰岛素原切除C肽而转化成高活性的小分子。 本文设计带有人工C肽胰岛素前体的结构IS，分别利用酵母菌和大肠杆菌的偏爱密码子，反向编码， 人工合成IS1和IS2 的基因，成功构建了毕赤酵母组成型表达菌株和大肠杆菌自剪切标签重组菌株，在毕 赤酵母中实现了IS1 的组成型分泌表达，再经过对表达产物的提取纯化、人工C肽的切除，获得具有生 物活性的人胰岛素。在大肠杆菌中实现了人胰岛素融合蛋白的高效表达，表达产物以包涵体的形式存在， 其复性工艺复杂，有待于进一步的研究。 经密码子优化并人工合成IS1基因，构建重组表达载体pGAPZa-IS1 ，电转化至感受态SM1168酵母 菌中，PCR鉴定阳性重组子；筛选高蛋白表达株并优化表达条件；表达产物经Tricine-SDS分析和 Western blot鉴定；表达产物经柱层析、超滤等纯化后，切除人工C肽，检测其降血糖活性。 结果表明 经双酶切和测序鉴定重组表达载体pGAPZaA-IS构建正确；表达产物经Tricine-SDS