三种脂质体法转染试剂转染原代大鼠气道平滑肌-中国医药生物技术.PDF

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三种脂质体法转染试剂转染原代大鼠气道平滑肌-中国医药生物技术

384 中国医药生物技术 2013 年 10 月第 8 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2013, Vol. 8, No. 5 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.05.010 ·技术与方法· 三种脂质体法转染试剂转染 原代大鼠气道平滑肌细胞效果的比较 徐玉东,王宇,魏颖,尹磊淼,杨永清 气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs ) 司;质粒提取纯化试剂盒购自天根生物科技公司;胎牛血清 是呼吸道的重要组成部分之一,受气道内各类免疫细胞所释 (FBS )购自美国 Gibco 公司;DMEM (高糖)培养基购 放的细胞因子和炎性介质的调节产生相应的收缩,其自身也 自美国 Hyclone 公司;胰蛋白酶购自美国 Sigma 公司; 能够分泌细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子和基质 CCK-8 细胞增殖试剂盒购自日本同仁化学公司。 金属蛋白酶等,参与气道炎症、气道高反应性与气道重塑的 1.1.4 主要仪器 IX81 型全自动倒置荧光显微镜购自日 发生发展,是研究哮喘、COPD 等气道呼吸性疾病细胞分 本奥林巴斯公司;Synergy H1 型荧光酶标仪购自美国 子机制的重要载体[1] 。国内外研究中使用的 ASMCs 大多从 Bio-Tek 公司;细胞培养箱购自德国 Binder 公司。 活组织(比如动物气管、支气管和活检样品等)中分离并原 1.2 方法 代培养获得,这比细胞系更能准确地模拟来源组织在体内环 1.2.1 大鼠 ASMCs 细胞分离和原代细胞培养 大鼠脱 境的特异性特征。 颈处死后放入 75% 乙醇浸泡 10 min 以消毒表皮,迅速分 在有关 ASMCs 的细胞学实验中,常通过细胞转染技 离气管及肺部组织,置入含 100 U/ml 青链霉素的 4 ℃ 预 术将外源目标分子如 DNA 、RNA 等导入 ASMCs ,以达到 冷 D-Hanks 液中。去除肺组织、支气管动静脉、脂肪和残 调控基因表达、突变分析和验证目标基因/蛋白功能等研究 存结缔组织,用眼科虹膜剪在培养皿中将气管段剪成 1 mm 目的。细胞转染大致可分为物理介导(如电穿孔、显微注射 × 1 mm 大小的组织块,用牙科探针贴于细胞培养瓶底面, 等)、化学介导(如脂质体法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡 等距间隔 0.5 ~ 1 cm ,将培养瓶倒置,加入含 10% 胎牛血 聚糖法等)以及生物介导(如原生质体转染、慢病毒/腺病 清的 DMEM (高糖)培养基 2 ~ 3 ml ,于 37 ℃,5% CO2 培 毒等)三种途径。其中脂质体转染法具有操作简便、细胞类 养箱中静置约 3 h ,轻轻翻转培养瓶,继续在培养箱中培养, 型广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点,可以用于瞬时转染, 待细胞爬出时换液。以后每 2 天换液一次,待细胞长到 也可用在永久表达系的建立,对转染的核酸类型和分子量有 80% 融合时,用 0.25% 胰蛋白酶消化,以 1 :2 比例传代, 很高的包容性,因此在转染技术领域被广泛应用[2] 。目前, 继续培养,取第 5 ~ 10 代的细胞用于实验。 在外源 DNA 转染中比较常用的脂质体法转染试剂包括 1.2.2 质粒 DNA 制备 真核表达质粒 pEGFP-C1 含有 Lipofectamine 2000 、FuGENE HD 、X-tremeGENE HP 等, CMV 启动子调控的 EGFP 基因,发出绿色荧光。将质粒 大量实验研究说明这些转染试剂对各类细胞系均有较高的 pEGFP-C1 转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3) ,挑出阳性克 转染效率。但是,对于转染难度较高的原

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