表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母高密度发酵分析及优化.pdfVIP

摘要 南极假丝酵母脂肪酶 B （Candida antarctica lipase B, CALB ）是主要的微生物脂肪 酶之一，在非水相反应体系中具有酯化、水解、转酯等多种催化特性，广泛应用于食品、 医药、洗涤及油脂等工业中。 将 CALB 展示于毕赤酵母细胞表面进行表达，可以作为一种菌体自固定化酶，无需 进行酶的分离纯化而可直接进行制备及应用。尽管表面展示 CALB 的表达水平与毕赤 酵母胞内基因结构关联较大，但发酵过程的调控作为其下游生产过程中的必经环节，始 终是下游生物工程中降低生产成本、提高外源蛋白表达量的重要途径。 本研究结合前期成果，首先在摇瓶培养中运用响应面方法对 FM22 发酵培养基进行 了优化，然后在 50L 发酵罐中对高密度发酵过程中的产酶温度及诱导初始菌体浓度进行 了研究。通过对发酵过程中胞内AOX 活力、ATP 含量、细胞存活率及胞外蛋白酶活力 等相关代谢参数的检测及分析，结合 DO 、OUR 等发酵在线参数的变化规律，研究毕赤 酵母表面展示 CALB 的代谢及发酵机理，得到以下结果： 1、对 FM22 无机盐培养基中的显著影响因素进行单因素实验，确定各因素的中心 值及高低水平。然后进行四因素三水平的 Box-Behnken 响应面实验，通过实验结果的回 归拟合及统计学分析，得到 FM22 培养基组分的最优浓度。毕赤酵母在优化后的培养基 中摇瓶发酵诱导 6d，表面展示 CALB 的表达量达 3214.7U/g-DCW，较优化前提高了40 ％。 2 、在 50L 发酵罐中研究产酶温度对毕赤酵母细胞生长及表面展示 CALB 表达的影 响，结果显示：在不同产酶温度条件下，毕赤酵母细胞生长趋势接近。而产酶温度作用 于胞内代谢的过程中，胞内 AOX 活力、ATP 含量、OUR、细胞存活率及蛋白酶活力等 胞内外相关代谢参数均发生变化，22 ℃发酵终点时 CALB 产量及单位表达量分别为 513U/mL 及 3484U/g-DCW，较 30℃分别提高了 73.3 ％和80.5 ％。采用流式细胞术对表 面展示 CALB 的毕赤酵母进行相对定量分析，验证了低产酶温度对 CALB 表达量的提 高。 3、针对低温产酶过程中发酵周期缩短的问题，对诱导初始菌体浓度进行研究。将 诱导初始 OD600 提高到 350，发酵过程的生物量及表面展示 CALB 产量分别提高了 14 ％和7.8 ％，诱导周期也延长至 120h。 本研究中通过对 FM22 无机盐培养基、产酶温度及诱导初始菌体浓度等发酵因素的   优化，将毕赤酵母表面展示 CALB 的高密度发酵产量提高到 553U/mL，较优化前提高 了 86.82 ％。 关键词：毕赤酵母；表面展示；南极假丝酵母脂肪酶B ；发酵产酶 Abstract Candida antarctica lipase B is one of the primary microbial lipase, which can catalyze esterification, hydrolyzation and transesterification in non-aqueous phase reaction system, widely applied in industries of food, medicine, detergent and lipid. CALB displayed on cell surface, acted as immobilized enzyme on Pichia pastoris, is easier to carry out preparation and application directly and avoiding separation and purification of enzyme. Although the expression level of CALB which displays on cell sur