第七章层析技术.PPT

第 五 章 层析技术 层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。 层析法最基本的特征是有一个固定相和一个流动相，当两相作相对运动时，由于混合物中各组分在物理化学性质 (如吸附力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲和力等)上的差别，使各组分在两相间进行反复多次的分配而得到分离。 层析类别 主要依据的理化性质 此类的层析方法举例 吸附层析 吸附力 磷酸钙凝胶层析 分配层析 分配系数 各种薄层层析、纸上层析 离子交换层析 分子的电荷性、极性 DEAE-纤维素柱层析 凝胶过滤层析 分子大小 交联葡聚糖柱层析 亲和层析 亲和分子间的亲和力 层析技术可按两相的状态不同进行分类，如以气体为流动相的叫做气相层析（gas chromatography），以液体为流动相的叫做液相层析（liquid chromatography）。 由于固定相也有液体和固体的不同，故气相层析还可细分为气—液和气—固层析两种，同理，液相层析即可细分为液—液和液—固层析两种。 根据流动相的形式： 液相层析、气相层析 层析基本操作过程 4、层析装置的仪器化 HPLC 层析前蛋白质处理 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。 第一节 凝胶过滤层析技术 又称凝胶排阻层析或分子筛方法 利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(多为凝胶)为填料，使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。 优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好 缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差 一、凝胶过滤层析的基本原理 多孔性亲水性凝胶 一是随洗脱液垂直向下移动 二是无定向的扩散运动。 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。 大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱 分配系数(kd) 体积参数 分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。 Kd＝(Ve一Vo)／Vi Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中， 因而洗脱速度最快。即该成分的Kd＝0。 Vi＝Ve-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部, 因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。 Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的 增加而降低 一般物质的Kd值是0Kd l。 Kd具有以下意义： （1）对于完全被排阻的极端大分子，由于Ve＝Vo，因此Kd＝O （2）对于能自由扩散凝胶颗粒内部的小分子物质，Ve＝Vo＋Vi，Kd＝1 （3）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，Kd在0～ 1之间 （4）凡Kd＞1的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而不仅仅是分子筛效应 （5）Kd值越接近1，表明分子越小，洗脱越慢；相反，Kd值越接近0，表明分子越大，洗脱越快。 影响分离效果的因素 流速 加样体积 样品