小鼠骨髓细胞微核试验指南.pptVIP

1 目的 通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法。 2 原理 微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规 律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。 微核成因 因此，微核试验用于检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂。 微核可出现在多种细胞中，但在有核细胞 中较难与正常核的分支相区别，由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此，通常计数PCE细胞中的微核数。 3 器材与试剂 3.1 器材 解剖器械，生物显微镜，载玻片等。 3.2 试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa 储备液、 pH 6.8磷酸盐缓冲液 3.3 阳性对照物 环磷酰胺 4 操作步骤 4.1 试验动物及处理 动物选择 小鼠是微核试验的常规动物，通常用7～12周龄，体重18～20g的小鼠。每组10只，雌雄各半。 剂量及分组 受试物应至少设三个剂量组，最高剂量组原则上为不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50 剂量。 另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺腹腔注射1次。阴性对照组使用等体积的溶剂。 染毒途径 腹腔注射 染毒次数及取样时间 一般采用两次或多次染毒。两次染毒：第一次染毒后24小时进行第二次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续5天，末次染毒后24小时取样。 4.2 骨髓液的制备和涂片 试验动物一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型止血钳将骨髓挤于有一小滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。也可在股骨取骨髓。 阳性及阴性对照组处理方法同上。 4.3 固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇溶液固定15分钟，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。 4.4 染色 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa (Giemsa储备液1份+pH6.8的磷酸盐缓冲液9份) 染色10~15分钟，冲洗，晾干。 4.5 观察计数 低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。 多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈橘黄色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色 。 计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 5 结果分析与评价 本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。 PCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCE值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。 阴性对照和阳性对照组的微核发生率，应与相关文献报道或研究历史数据相一致。 * * 化学致突变物 染色体 作用于纺锤丝 无着丝点,片或环 整条染色体 带着丝粒的环和断片 于细胞分裂末期细胞质中 形成微核 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成 MN NCE 红细胞 电镜