分子生物学技术2.pptVIP

分子生物学 5’ gaaaaagtcagaaatttatcctaaaaattctgcagaatcaaaaaccacaatgaccctc ggggtttccacttggaaaattattacaaactgtatttttgcttatgagctttatattgcactgcc ctgaactgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctcccc agTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATT CAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttca tttgtttactcctccacattatctttattgcttaactcctcaccaccttcacctctaaaataaatttgagtttttacattattttcaccagttcaagggtccctcagactgct 3’ 5’ctgtatttttgcttatgagctttatattgcactgccctgaactgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctccccAgTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccacattatctttattgcttaactcctcaccaccttcacc 3’ 5’aaacccttttctccccagTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttc 3’ (第一对引物扩增） (第二对引物扩增） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 内对照 1 2 3 AZF区的缺失检测 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4 不同病毒的引物用不同颜色的荧光标记 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 高浓度引物 低浓度引物 ＲＴ－ＰＣＲ 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA模板 杂化双链 PCR扩增 cDNA文库的构建 1、制备mRNA 从总RNA中分离mRNA。 2、逆转录合成cDNA 用寡聚T引物（12-18bp）和随机寡核苷酸（6bp)引物进行逆转录PCR。 cDNA第一链 cDNA第二链 PCR (加接头） 限制酶切点 3、与载体连接 ，导入宿主细胞。 诱变寡核苷酸引物 单链M13噬菌体 DNA聚合酶延伸引物 转染大肠杆菌，进行复制 筛选突变体，测序鉴定 突变体 FM R2 F1 RM PCR3 PCR1 变性 复性 延伸 FM、RM错配引物 PCR2 PCR4 F1 R2 dNTP ddNTP DNA沿3’端延伸 ddATP参入后，DNA延伸终止 * 大理学院生化学院 阿周存 第三节：聚合酶链反应（PCR） 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction PCR ）技术是Kary Mullis发明的。它是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链锁反应，大家很快地纷纷采用这个方法在短短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近三十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。 PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成，通过变性，待扩增的靶DNA双链成为两条单链DNA模板；退火时,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一热