高抗菌活性乳酸菌筛选附菌种鉴定.docVIP

高 抗 菌 活 性 乳 酸 菌 的 筛 选 及 菌 种 鉴 定 摘 要：研究旨在筛选适用于饲料青贮的高抗菌活性乳酸菌，并进行菌种鉴定。以藤黄微 球菌、沙门氏菌、大肠杆菌为指示菌，通过牛津杯双层平板法对从玉米、水稻、蔬菜残渣、猪粪、鸡粪等样品中分离出的121株乳酸菌进行抑菌试验。通过生理生化，碳源发酵试验和16SrRNA分子鉴定及recA基因扩增对所选菌株进行鉴定。菌株ZZU 575具有较强抗菌活性，排除酸、过氧化氢干扰后，其发酵上清液对大肠杆菌抑制作用消失，但对藤黄微球菌及沙门氏菌仍有很强的抑制活性；其抑菌活性在酸性条件下较强，在加入蛋白酶K和胰蛋白酶以及100 ℃以上热处理时明显下降甚至消失；ZZU 575被鉴定为植物乳杆菌。菌株ZZU 575在饲料青贮中具有潜在应用价值。 关键词：乳酸菌；抑菌活性；16S rRNA；recA 乳酸菌是一种广泛分布于自然界而且普遍应 用于食品、医药、饲料等领域的益生菌。乳酸菌可 以产生多种抑菌物质，包括有机酸，过氧化氢及细 菌素等；其中细菌素是由微生物通过核糖体合成 机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白类物质，抑 菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细 菌素具有自身免疫性。细菌素与抗生素不同，一 些抗生素杀死病原微生物的同时，还会破坏动物 肠道正常菌群，导致菌群失调、抵抗力下降，疾病 的发病率增加等不良情况。而乳酸菌产生的细菌 素因其具有无毒性，无抗药性，易被消化道中的蛋 白酶降解，不易在体内蓄积引起不良反应等特性， 已经引起开发高效安全饲料添加剂科研人员的密 切关注 [1-5] 。细菌素可防止饲料本身被沙门氏菌等 致病菌的污染，防止致病菌对动物的危害，并且可 限制带菌动物排泻物中病原微生物的传播。我国 农业部第105号公布的允许使用的饲料级微生物 添加剂共12种，植物乳杆菌是其中的一种；菌体本 身与所产植物乳杆菌素在饲料中主要应用于青贮 饲料、微生物发酵饲料及饲料添加剂等方面 [6-7] 。 尽管乳酸菌在饲料青贮中已有所应用，但由于饲 料种类繁多，分布区域环境条件差异较大，仍然需 要广泛筛选优良乳酸菌，开发新的适合具体需求 的高效饲料青贮用乳酸菌添加剂。分离筛选高抗 菌活性的乳酸菌，不仅有利于饲料青贮，还可以 应用于食品、饲料的杀菌防腐和微生态制剂的研 究开发。本实验筛选出一株抑菌活性较强的乳 酸菌，并对其生物学特性进行研究，旨在为这一 菌株作为饲料青贮添加剂的开发应用提供理论 依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株 乳酸菌菌株共121株，分离自玉米、水稻、蔬 菜残渣、猪粪、鸡粪等样品；指示菌有藤黄微球菌、 大肠杆菌、沙门氏菌，均为实验室保存。 1.1.2 试剂及培养基 过氧化氢酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、菌株DNA 提取试剂盒、MRS培养基、NA培养基。 1.2 方法 1.2.1 高抗菌活性菌株的初筛 将保存于-80 ℃冰箱中的乳酸菌活化后，接 种到MRS 液体培养基，30 ℃培养48 h。发酵液 经 10 000 r/min离心5 min，取上清液用于高抗菌 活性乳酸菌的筛选；采用牛津杯双层平板法 [8] 测定 其抑菌活性。 1.2.2 产细菌素菌株的复筛 乳酸菌在生长过程中会产生许多具有抑菌作 用的物质，如有机酸、过氧化氢等，因此在筛选细 菌素产生菌时需要排除这些因素的干扰，并初步 确定其抑菌物质是蛋白质类物质。 ① 酸抑制作用的排除：选取对三种指示菌均 有抑制作用的菌株，按上诉方法制备发酵上清液， 测上清液的pH值，用2 mol/l NaOH和2 mol/l乳酸 调发酵上清液pH值至5.0，并用乳酸调未接种的 MRS液体培养基pH值至5.0作为对照；用牛津杯 双层平板法做抑菌实验。 ② 过氧化氢酶作用的排除：选取酸排除后依 然有抑菌作用的乳酸菌菌株制备发酵上清液，调 pH值至7.0，按照过氧化氢酶终浓度为5.0 mg/ml加 入到发酵液中，37 ℃水浴2 h，再将pH值调至5.0， 检测过氧化氢酶处理后发酵上清液的抑菌活性。 ③ 蛋白酶解检测：选取筛选出的乳酸菌制备 发酵上清液，调发酵上清液到胰蛋白酶和蛋白酶K 的最适作用pH值，按1.0 mg/ml加入胰蛋白酶和蛋 白酶K，同上处理，检测胰蛋白酶和蛋白酶K对乳 酸菌发酵上清液抑菌活性的影响。 1.2.3 细菌素生物学特性初步鉴定 ① 热敏感性：将发酵上清液分别置 60、80、 100 ℃水浴锅 30 min 和 60 min，121 ℃灭菌锅 15 min；冷却后进行抑菌实验。 ② pH敏感性：发酵上清液，用1 mol/l 乳酸和 1 mol/l NaOH 调其pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、 6.0、7.0、8.0、9.0，37 ℃温育2 h后，进行抑菌实验。 1.2.4 产细菌素乳酸菌的鉴定 ① 菌