(动物传染病学实验课件)3 细菌的药敏试验.ppt

实验三 细菌的药敏试验 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料 四、实验方法和步骤 五、思考题 一、实验目的 1.了解抗生素和抗生素抗性的作用机制。 2.掌握药敏试验的原理和临床意义。 3.掌握药敏试验扩散法的实验操作。 1.抗生素作用机制 ①影响细胞壁的合成，如青霉素、万古霉素； ②抑制蛋白质的合成，如四环素、氯霉素； ③作用于细胞膜，如多粘菌素、多烯类化合物； ④抑制核酸的合成，如利福平、氯喹； ⑤干扰酶系统，如大环内酯类。 2.抗生素抗性作用机制 青霉素 β-内酰氨分子相似于肽聚糖单体，可与转肽酶抑制性结合，从而抑制肽聚糖多链的合成（主要针对G+细菌)。 氯霉素与氯霉素抗性 细菌细胞的70S核糖体是合成蛋白质的主要细胞成分，它包括50S和30S两个亚基。氯霉素通过可逆地与50S亚基结合,阻断转肽酰酶的作用，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成（广谱抗菌）。 基因组突变导致抗生素分子不能与作用位点结合。 抗性质粒含有氯霉素乙酰转移酶，修饰氯霉素分子。 四环素和四环素抗性 与16S rRNA结合抑制细菌蛋白质的合成。 抗性质粒编码一个蛋白泵可以将四环素分子泵到细菌细胞外面。 3.药敏试验 稀释法 三、实验材料 被检细菌: 麦氏比浊管 药敏纸片 灭菌生理盐水 培养皿和棉签 四、实验方法和步骤 1.细菌培养：挑取菌落4~5个，接种于肉汤培养基中，置37℃培养6~12小时。 2.比浊：取1ml的细菌悬液，用麦氏比浊管测定浓度。 3.稀释：根据测定的浓度和终浓度（1.5亿/ml），计算出需要补加的生理盐水的量，进行稀释和矫正。 4. 菌液涂布：用无菌的棉拭子蘸取上述细菌悬液，用棉拭子涂于琼脂表面，盖好平皿，在室温干燥5~10 min，待平皿表面稍干后再放含药纸片。 5. 贴药敏纸片：用镊子取出含药纸片贴在涂有细菌的平皿表面，之后轻轻按压。（将学号或姓名写在平皿上） 6.将平皿放在37℃温箱中培养16~18h，观察结果。 7.结果观察：次日上午9:30-10:00，407室 有无污染； 有无抑菌环； 量其直径大小(mm)。 实验分组 平皿：2人/个 棉签：2人/支 五、思考题 1.药敏试验的临床意义是什么？ 2.怎样可以减缓抗生素抗性/细菌耐药性的产生？ * * 二、实验原理 1929年英国科学家弗莱明发现青霉具有抗葡萄球菌的能力； 1939年，牛津大学弗洛里与钱恩二人利用发酵的方法，成功提取出了青霉素 抗性质粒编码β-内酰氨酶，可以破坏青霉素分子中的酰氨键从而使青霉素失活。 1.稀释法：待检细菌接种于不同稀释浓度的固体或液体培养基上，测定MIC或MBC。 2.扩散法：抗菌药物置于接种细菌的固体培养基上，测定待检细菌的抑菌环。 MIC：Minimal inhibition concentration MBC：Minimal bacteriocidal concentration 抗菌药物稀释成不同浓度 接种待测菌进行培养 测定细菌的最低抑制浓度(MIC） 或最低杀菌浓度（MBC） 精确 扩散法 接种待测菌在固体培养基上 将抗菌药物置于接菌培养基上 抗菌药物向培养基中扩散，形成浓度梯度 抑制细菌的生长，从而出现抑菌环 根据抑菌环的大小， 判定细菌对药物的敏感度 定性 细菌培养 比浊稀释 菌液涂布 贴药敏纸片 无菌操作 直径9cm *