The central and peripheral pathways of the cerebellar fastigial nucleus regulating immune system function小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径.pdf

基金资助：国家自然科学基金面上项目 江苏省自然科学基金项目：BK2010278 南通市应用研究计划项目：K2009047 小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径 中文摘要 目 的： 我们实验室以前的研究表明小脑顶核可参与调节淋巴细胞功能。由于小脑与免疫 系统之间没有直接的结构上的联系，因此探讨小脑调节免疫功能的途径和机制对于更 好地理解小脑的免疫调节功能具有重要的意义。下丘脑是中枢神经系统中重要的免疫 调节中枢。为此，本研究一方面进一步揭示小脑顶核至下丘脑的神经投射路径及性质； 另一方面，在上述研究的基础上分别研究小脑顶核至下丘脑γ- 氨基丁酸（γ -aminobutyric acid, GABA ）能和谷氨酸能神经投射对淋巴细胞功能的影响，以探讨小 脑顶核调节免疫功能的中枢和外周途径，进一步拓宽和加深对小脑神经免疫调节的认 识和理解。 方 法： 1. 单侧小脑顶核内微量注射葡聚糖- 德克萨斯红（Texas red dextran amine, TRDA ），顺行追踪顶核至下丘脑的神经投射路径及终止部位。单侧下丘脑外侧区 （lateral hypothalamic area, LHA ）内微量注射逆行追踪剂红色荧光金（Fluoro-Ruby, FR ），结合 GABA 和谷氨酸免疫荧光组织化学染色，进一步确定顶核至下丘脑投射的 性质。 2. 双侧小脑顶核内微量注射 GABA 降解酶—GABA 转氨酶的抑制剂氨已烯酸 （vigabatrin, VGB ）或 GABA 合成酶— 谷氨酸脱羧酶的抑制剂 3- 巯基丙酸 （3-mercaptopropionic acid, 3-MP ），并以未作任何处理的空白大鼠和双侧小脑顶核注 射等量生理盐水的大鼠作为对照。注射后第 3 天，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （carboxyl fluorescein succinimidyl ester, CFSE ）和抗CD3 抗体流式双标技术检测 T 淋巴细胞对刀豆蛋白 A （concanavalin A, Con A ）刺激的增殖反应；用酶联免疫吸附 法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）检测血清中抗绵羊红细胞（sheep red blood cells, SRBC ）特异性 IgM 抗体水平；动物于第 6 天加强注射药物，3 天后用 CAM/EH-1 流式双标技术检测脾脏自然杀伤（natural killer, NK ）细胞杀伤肿瘤靶细胞 I YAC-1 的活性。在检测淋巴细胞功能的同时，用 FR 逆行追踪结合 GABA 免疫组化 染色检测顶核至 LHA 投射中 GABA 能神经元数目的变化，并用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC ）检测下丘脑中GABA 的含量变化。 3. 大鼠用小牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA ）进行免疫。免疫后第3 天，双侧小脑顶核内微量注射谷氨酸合成酶—谷氨酰胺酶的抑制剂 6-重氮-5-氧代-L- 正亮氨酸（6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON ），同时双侧 LHA 或丘脑腹外侧核 （ventrolateral thalamic nuclei, VL ）内微量注射谷氨酸膜转运体抑制剂苏式-3-羟基天 冬氨酸（D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA ）。动物饲养3 天，用抗 CD3，CD4， CD8，CD45RA 和 NKR-P1A 抗体标记流式检测外周血中 T 细胞及其亚群，B 细胞和 NK 细胞的百分比变化；用 CD3/CD25 和 CD3/CFSE 流式双标技术分别检测肠系膜淋 巴结T 细胞对 Con A 刺激的活化和增殖能力；用 real-time PCR 法检测淋巴结 T 细胞 中细胞因子IL-2，IFN- γ，IL-4，IL-5，IL-10 ，TGF-β，IL-22 ，