神经元凋亡时Egr-1对Bim表达调控的研究.pdfVIP

中山大学硕士论文 神经元掏亡时Eg-1对Bim表达调拄的研究 i m表达调控的研究 神经元凋亡时Egr一1对B 专业：神经生理学 硕士生：刘艳玲 指导老师：刘先国教授 黎明涛教授 摘 要 小脑颗粒神经元fCGNs)是哺乳动物脑中最丰富的中枢神经元。体外培养该 神经元时，含25mM KCI(高钾)的培养基可维持小脑颗粒神经元的分化、成熟和 存活，而去血清、复极化浓度的KCl(SmM，低钾)培养基可诱导分化成熟的小 脑颗粒神经元凋亡。正因为小脑颗粒神经元来源丰富、体外培养的同质性高，所 以此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究和防治与凋亡有关的 神经系统疾病的新药开发中。 转录、转录后和翻译后三个水平进行调控。一些研究结果表明JNK／c-jtm通路、 尚存在争议；转录后调节主要体现在尽管多种Bim转录子在神经元中都可形成， 但表达产物却以BimEL蛋白为主；此外，翻译后调节也是Bim活性调控的重要 方式：通常情况下BimEL和BimL与微管复合体动力蛋白轻链LC8结合被阻滞于 胞浆，凋亡刺激使它们释放并与Bcl．2结合发挥促凋亡作用：另外，已经证明 切后的BimEL与Bcl．2的亲和力增强，从而进一步促进凋亡。Bim转录调控是近 年来神经元凋亡机制研究中的热门课题。研究表明转录因子Egr01在神经元凋亡 中发挥了重要作用，但它的作用靶点尚不清楚。本研究采用免疫印迹、基因转染、 报告基因等技术迸一步探讨了在神经元凋亡中Bim表达的调控机制和Egr-1在神 经元凋亡中的作用机理，渴望能为确立防治神经退行性疾病的药物开发新靶点提 中山大学硕士论文 神经元捌亡时Egr-1对Bim表达调控的研究 供线索。 33258 方法：小脑颗粒神经元的原代培养；相差显微镜观察细胞形态；Hoechst 荧光素核染色观察神经元核形态、检测凋亡率；转基因、报告基因研究基因功能； 蛋白免疫印迹法检测Egr-1、Bim蛋白水平的变化。 结果： 1．低钾诱导Egr一1的表达，激活Egr一1反应元件 1．1用特异的抗Egr一1抗体进行免疫印迹，结果显示低钾处理后，小脑颗 粒神经元Egr一1蛋白水平迅速升高，2小时后迅速下降。 1．2 Egr—l反应元件报告质粒转染16h后予低钾处理，8h后测报告基因， 结果显示Egr—l反应元件明显被激活。 2．Egr—l在CGNs凋亡中发挥了重要作用。转染负显性的Egr一1可抑制低钾诱导 的神经元凋亡。 3．低钾使Bim启动子的转录活性升高 3．1 用特异的抗Bim抗体进行免疫印迹，结果显示低钾处理后CGNs中Bim 水平持续升高。 3．2 Bim报告质粒转染16h后，低钾处理8h测报告基因，结果显示Bim启 动子明显被激活。 4．Egr—l调控了Bim的表达 4．1 负显性的Egr一1表达质粒抑制了Egr一1反应元件的转录活性，证明负 显性Egr一1质粒的有效性。 4．2负显性的Egr一1表达质粒抑制了Bim启动子的转录活性。 4．3 NAB2表达质粒抑制了Egr一1反应元件的转录活性，证明了NAB2质粒 的有效性。 4．4 达调控的特异性。 结论：低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，Egr一1上调了Bim的表达。 关键词：小脑颗粒神经元；凋亡；Bim：Egr一1 II 中山大学硕十论文 神经元凋亡时Egr-I对Bim表达调控的研究 The on Bim