融合蛋白GGH氮端延长类似物的克隆表达、分离纯化及初步活性评价.pdf

摘要 摘 要 融合蛋白GGH 是由两个人胰高血糖素样肽-1 突变体和人血清白蛋白HSA 融合而成 的重组蛋白，与单体GLP-1 相比，GGH 不仅可以促进β 细胞的增殖、胰岛素的分泌， 还大大的提高了体内的半衰期，但其活性并没有达到预期，主要原因可能是氮末端的不 完整，针对这一点，本文对GGH 的氮端添加氨基酸延长修饰，设计出5 种GGH 的氮 端延长类似物，成功构建了表达5 种类似物的基因工程菌，并分离纯化得到五个类似物， 进行了活性的筛选和鉴定，主要结论如下： （1）对母体融合蛋白GGH 进行了5 种方法的延长修饰，即DAH-GGH、MSY-GGH、 TFT-GGH、A-GGH 和G-GGH，针对延长修饰的思路，首先设计出含有延长氨基酸核酸 序列的引物，PCR 扩增得到类似物的基因，构建了GGH 类似物的重组表达载体，转化 子经过菌液PCR 、双酶切和测序验证后，以P.pastoris GS115 为宿主成功的构建了GGH 氮端延长修饰的5 个类似物的表达菌株。 （2 ）融合蛋白GGH 类似物的毕赤酵母表达菌株发酵表达条件是：120 mL/三角瓶 体积的装液量，pH 6.0 、30℃、200 r/min 、2% 的甲醇诱导浓度、诱导时间72 h，五株菌 株的蛋白表达量为150 -160 mg/L 。 （3 ）融合蛋白GGH 类似物分离纯化的步骤是：冷冻离心：4 ℃、8000 r/min 冷冻离 心10 min，收集上清，超滤浓缩20 倍，调节电导为13.0 mS/cm。依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow 层析、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 层析、Q Sepharose Fast Flow 层析和 Sephadex G-25 凝胶层得到纯度为98.0%GGH 的类似物，SDSPAGE 考马斯亮蓝染色和银 染证实了纯化蛋白的纯度，纯化过程总回收率达到33.3% 。 （4 ）体外活性结果显示TFT-GGH，A-GGH 与 G-GGH 均可以显著的促进 cAMP 的生成，且A-GGH 与G-GGH 的体外活性比母体蛋白GGH 提高了 10 倍。小鼠体内糖 耐量实验结果表明A-GGH 与G-GGH 还可以显著控制KM 小鼠口服葡萄糖后血糖的增 幅，而且类似物A-GGH 在给药24 h 后仍可以显著的发挥控制血糖增高的效果。 （5 ）对体内外活性较高的类似物A-GGH 进行质谱法分子量测定，结果发现测定出 4 4 4 峰值在6.8 ×10 和7.15×10 m/z ，发现它产生了一个新的出峰7.15×10 m/z ，此峰分子 量接近其理论分子量（72 kD ），分子量测定结果证明类似物A-GGH 的稳定性有所提高。 关键词：融合蛋白GGH ；类似物；毕赤酵母；表达；纯化；活性 I Abstract Abstract GGH is a fusion protein of two human glucagon-like peptide-1 mutant and human serum albumin. Compared with GLP-1, it can not only stimulate the searetion of insulin and the growth of β cells but also show longer half-life than GLP-1. However, it did not effect as expected because of its incomplete N-terminal residues. In this study we des