大豆GmHAT5的克隆及其转基因百脉根的抗盐分析-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2017,50(9):1559-1570 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.09.002 大豆 GmHAT5 的克隆及其转基因百脉根的抗盐分析 柯丹霞，李祥永，王磊，程琳，刘永辉，李小艳，王慧芳 （信阳师范学院生命科学学院/大别山农业生物资源保护与利用研究院，河南信阳 464000 ） 摘要：【目的】从大豆盐胁迫基因表达谱中筛选并克隆得到同源异型域亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）家族基因 GmHAT5，将其转化豆科模式植物百脉根并进一步探究其抗盐调控机制。【方法】使用多种生物信息学软件对GmHAT5 的开放读码框（ORF）、编码蛋白的分子量、等电点、序列结构和蛋白定位等进行预测，同时将大豆GmHAT5蛋白与 其他 10 个物种的同源蛋白进行比对分析，并对 GmHAT5 在大豆不同器官及盐胁迫下的表达特性进行分析。此外， 构建 GmHAT5 的植物超表达载体，通过对发根农杆菌LBA1334的转化，得到“复合体”百脉根植株，并在盐胁迫条 件下对其进行抗盐表型分析；通过对根癌农杆菌EHA105的转化，获得百脉根的稳定转化株系, 并对其进行抗盐表 型分析及相关生理指标检测。【结果】多种生物信息学软件分析表明，该片段包含1 个1 038 bp的 ORF，编码345 个氨基酸。GmHAT5 的理论分子量和等电点分别为 39.17 kD 和 4.63。GmHAT5 蛋白定位于细胞核，与其他 HD-Zip 家族蛋白一样，属于典型的核蛋白。序列分析表明，GmHAT5包含一个同源异型结构域和一个亮氨酸拉链结构域， 属于第I类同源异型域亮氨酸拉链蛋白。同源蛋白比对表明其与野生大豆GsHAT5同源性最高。基因表达特性分析 表明，GmHAT5 在大豆植株的各个不同器官中均有表达，是一个受盐诱导上调表达的 HD-Zip 类转录因子。发状根 转化的结果表明，使用200 mmol·L-1 NaCl处理植株7 d后，“复合体”植株生长状态良好，对照组植株叶片明显萎 蔫、失绿；不同 NaCl 浓度处理离体转基因发状根 14 d 后，对照组较试验组发状根明显干枯、生长受到抑制。稳 定转化结果显示，不同盐浓度处理 14 d 后，转 GmHAT5 百脉根与两组对照植株相比生长状态更好。相关生理指标 检测结果显示，与两组对照相比，转基因百脉根植株中丙二醛含量和相对质膜透性明显降低（P ＜0.05）, 而叶绿 素含量和根系活力则显著升高（P ＜0.05）。测定不同植株阳离子含量的结果表明，转基因百脉根株系与两组对照 相比，Na+ + 2+ 在叶片和根中含量显著下降，K 和Ca 在叶片和根中含量显著升高。【结论】从大豆中克隆得到一个编码 HD-ZipⅠ类同源异型域亮氨酸拉链蛋白基因 GmHAT5，该基因在大豆中受盐胁迫诱导表达量显著升高。超量表达 GmHAT5 显著增强百脉根的耐盐能力，发状根转化法可以作为一种快速有效筛选抗盐候选基因的手段。推测 GmHAT5 在大豆盐胁迫应激调控中扮演重要角色。 关键词：大豆；同源异型域亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）；转录因子；百脉根；耐盐性 Isolation of GmHAT5 from Glycine max and Analysis of Saline Tolerance for Transgenic Lotus japonicus KE DanXia, LI XiangYong, WANG Lei, CHENG Lin, LIU YongHui, LI XiaoYan, WANG HuiFang (College of Life Sciences, Xinyang Normal University/Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang 464000