蛋白质和酶的提取分离.PPT

章节内容 经验 溶剂和溶解度 蛋白质和酶的提取 酶在细胞中的分布 分离纯化的一般步骤 细胞破碎 酶的提取 分离纯化方法 提取的好坏受到多种因素的影响，包括：　　1）溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂（如尿素和盐酸胍）和粘稠度、溶液的更换；　　2）材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理；　　3）目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量；　　4）其它因素 搅拌、提取时间的长短。 溶剂和溶解度 一. 溶剂　　一些常用溶剂按其极性的大小，可依顺序大体排列如下：饱和烃类全卤代烃类不饱和烃类醚类未全卤代烃类～脂类酮类醇类。　　还可按形成氢键能力的大小，分为五类：　　 1）能形成两个以上氢键的溶剂分子 如水，其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键；　　2）能形成两个氢键的溶剂分子 既是氢键的供体又是氢键的受体，例如脂肪族的醇类；　　3）只作质子受体的溶剂分子 如脂肪族的醚类；　　4）只作质子供体的溶剂分子 如氯仿；　　5）不能形成氢键的烃类 如四氯化碳。　　 二．溶解度 　　溶解度用于分离提纯有两个主要目的：1）选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使制备物从组分中有选择地被孤立出来；2）或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使制备物从组分中沉淀或结晶出来。　　 1． 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点：　　1）极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性溶剂中；　　2）碱性物质易溶于酸性物质中，酸性物质易溶于碱性物质中；　　3）在极性溶液中，溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。 2． 影响物质溶解度的几个主要因素： 1）离子强度 　A．有些物质，如DNA-蛋白，在高离子强度下溶解度增加。 DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。 RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性质，先提取得到RNP。 B．另一些物质，如绝大多数球蛋白和酶，在低离子强度下溶解性增加，称为盐溶；而在高离子强度下溶解度下降，直至出现沉淀，称为盐析。 蛋白质和酶在水溶液中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质和酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。 而当盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质和酶的溶解度又随着盐浓度的升高而减少，结果使蛋白质和酶沉淀析出，这种现象称为盐析。在某浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶的溶解度各不相同，故此可达到彼此分离的目的。 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，K2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。 C．盐溶现象不仅在水溶液中发生，而且在低介电常数溶剂，如乙醇，也同样发生。故而稀盐液常用于大多数生化物质的提取。 2）pH 值 　　A．两性溶质分子，在等电点时易相互聚集，溶解度最低；而在远离等电点两侧的pH值时，溶解度增大。　　B．一些酸性或碱性小分子物质，在pH值很低时酸性物质呈现非解离分子状态，而碱性物质呈现阳离子状态；反之，酸性物质呈现阴离子状态，而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状态的物质，不论是阳离子或阴离子都易溶于水，非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。　　 C．对蛋白质、酶、核酸等生物大分子来说，应避免过酸或过碱，一般控制在PH6-8范围。如单纯从溶解度考虑，等电点在酸性范围的蛋白或酶，可选用偏碱性溶液提取；等电点在碱性范围内，则选用偏酸性溶液提取，酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键，并有利于细胞的溶解。 3）温度 　 A．温度的提高可增高物质的溶解度，减少溶液的粘度，有利于提取的进行。对于一些植物成分或某些小分子生化物质，提取温度常在50-70℃。　　 B．热提取法虽然提高提取效率，但所得提取液含杂质较多，不如冷提取法。对绝大部分生物大分子而言，提取温度一般控制在0～10℃之间，以防止生物大分子的变性。 4）去垢剂 去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取中应用的较多。 A．中性