单细胞水平与同位素拉曼散射分析.pptxVIP

单细胞同位素拉曼散射分析中国农业大学齐孟文前言 细胞是生物体结构和功能的基本单位，环境生态中的所有物质转化和生命活动现象，只有基于细胞的分析才能得到本质上的阐述，而细胞的生命驱动力是细胞代谢，解析细胞代谢的过程，展现其瞬时动态图像，是一切生物转化相关过程研究在方法学上必须最终解决的问题，其关系到生态学，环境学，生物学，生物医学等众多相关领域，具有重大意义。 单细胞同位素拉曼散射是一种非破坏性的，非细胞培养的，集共聚焦显微、拉曼非弹性散射及其与同位素标记探针技术结合为一体的分析技术。共聚焦显微可以实现分析对象在细胞或亚细胞尺度上的测度，而拉曼非弹性散可以贯穿细胞，包含有几乎所有细胞储藏大分子指纹的信息，加之水介质的拉曼背景信号小，可实现对细胞的整体分析，若同时采用同位素探针技术，可以将功能过程示踪与生物系统发育信息相联系，进行功能与分类的耦合分析，以及元素生态循环和细胞代谢等系统生物学研究。 1.激光共聚焦显微成像技术 以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行光后，再由物透镜聚焦在样品上，对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描，样品激发的光信号，通过分光镜分光，再经像透镜聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏所阻挡，因而不能不能被检测。这种双共轭成像方式称为共聚焦。基本原理 利用放置在光源后的照明针孔(P1)和放置在检测器前的探测针孔(P2)实现点照明和点探测，激光经过照明针孔形成点光源，由物镜聚焦在样品焦面的某个物点上，只有该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何位置发射光线被探测器阻挡，不能到达PMT探测器，从而提高了成像效果。照明针孔和探测针孔共轭聚焦，所有被探测点均在物平面为共焦的平面。技术指标分辨率人眼：0.2mm；光学显微镜：0.25?m；电子显微镜：0.2nm；共聚焦显微镜：0.18 ?m。 较之传统显微镜1）抑制图像的模糊，成像更清楚；2）具有更高的轴向分辨率，可连续层相成像；3）增加侧向分辨率。2.曼非弹性散射光谱自发拉曼光谱 入射光被其诱导的分子极化场所散射而频率发生变化的光谱，在每条入射光频率V0的两侧对称地分布着频率为V0??Vi的谱线，其中?V相应于分子的某一振动跃迁频率，长波一侧的谱线称为红伴线或斯托克斯线，短波一侧的谱线称为紫伴线或反斯托克斯线。 谱线特征 1）与入射光的频率无关，而由散射物质分子的振（转）能级所决定，因此有些谱线是与红外吸收谱线相一致。 2）在以波数为变量的拉曼光谱图上，斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两侧，上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个分子声子的振动能量。 3）一般情况下，斯托克斯线比反斯托克斯线的强度大，因为依据Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。 分析特征1）利用待测样品分子的特征拉曼谱线作为检测或灰度对比度成像，无需引入外源标记物（同位素由底物引入，认为是内原的），因此是非侵入式的测量；2）水的拉曼背景信号较小，因此可在水环境下测量；3）一般采用近红外光激发，对细胞组织的光损伤较小，能够穿透较厚的生物样品，有利于长时间采集样本和进行样品内部测量；4）不利因素是自发斯托克斯的信号较弱，只有106-108个光子，影响探测灵敏度的提高。测量装置增强拉曼光谱 自发拉曼光谱的主要不足是信号太弱，若一味提高激发光的强度，可能会损伤细胞，同时采样时间太长也不利于动态过程的测定，目前提高信噪比的两种基本办法是：表面增强拉曼散射和相干反斯托克斯光谱两种分析策略。 1）表面增强拉拉曼光谱 将样品与胶质金属颗粒如银、金或铜混合，或吸附在这些金属片的粗糙表面上吗，发现光谱的强度可提高103-106倍。一般认为具有一定表面粗糙度的类自由电子金属基底的存在，使得入射光在表面局域的电磁场得到加强，而拉曼散射强度与分子诱导极化化率平方成正比，因此极大地增强了表面吸附分子的拉曼效应。 2）共振反斯托克斯拉曼光谱 该过程是一种三阶非线性光学过程，通常采用两束中心频率不同的激光脉冲，分别作为抽运光（?L）和斯托克斯光（?S）来激发样品分子，当两束激光的频率差与分子某一振动模式的固有振动频率一致时（?R=?L-?S）， 分子的固有振动模式得到共振增强，并在第三束探测光（?P）的作用下产生反斯托克斯信号（?AS）， 其能级图如图所示，分为两步，第一步，抽运光和斯托克斯光脉冲同时到达样品使分子共振激发，在湮没一个抽运光光子的同时产生一个斯托克斯光子和一个相干声子；第二步, 产生的相干声子随后与探测光光子作用, 反射反斯托克斯光子。 共振反斯托克斯拉曼光谱显著地提高了信号强度，同时由于信号相对蓝移，可以很好的与激发光分开，而过程存在