蛋白质的提取和分离2.ppt

课题3 血红蛋白的提取和分离（2） 利用透析袋透析 装配好的凝胶柱 收集得到的纯化后的蛋白 * 1.凝胶色谱法分离蛋白质的原理 2.电泳分离蛋白质的原理 3.常用的电泳的方法 4.缓冲液的作用 5.血红蛋白的组成 6.蛋白质提取和分离的一般步骤 复习回顾 专题5 DNA和蛋白质技术 1、红细胞的洗涤 阅读课本内容，回答以下问题： 1、洗涤的目的？ 2、怎样洗涤？ 3、洗涤干净的标志是什么？ 1 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 2 采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次 3 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 实验操作 （一）样品处理 1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。 问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 1、红细胞的洗涤 2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 实验操作 （一）样品处理 2.血红蛋白的释放 血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 说出：蒸馏水和甲苯的作用。 实验操作 （一）样品处理 3.分离血红蛋白溶液 问： 1、采用什么方法分离血红蛋白？ 2、离心分层后，各层的成分各是什么？ 3、用滤纸过滤，去掉什么成分？ 实验操作 （一）样品处理 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。 4.透析 问：透析过程及透析目的？ 透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。 实验操作 （一）样品处理 4.透析 实验操作 （一）样品处理 凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 2、凝胶色谱柱的装填 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 缓冲液洗涤平衡 ⑤ 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 装填悬浮液 ④ 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 配制悬浮液 ③ 根据色谱柱体积计算凝胶用量 计算称量凝胶 ② 色谱柱垂直固定在支架上 操作要求 ① 操作要求 步骤 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 （2）凝胶色谱柱的装填 50cm高 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，