细胞培养原与代培养传代培养.ppt

器械的清洗 为何要进行清洗？ 离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，这些物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。 除一次性用品外，玻璃、塑料、橡胶和金属质地等其他培养用品，无论新旧，使用前均需彻底清洗。 2 清洗步骤： 泡在含有洗洁净的自来水中→捞出来用毛刷将实验器具各个面刷洗至少25遍→自来水冲洗25遍→过一遍一蒸水→烘干→泡入铬酸过夜→ 从铬酸中捞出器具，自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子备用→用前高温灭菌（121℃，25min） →烘干→使用 注意：1、新的玻璃器具先要泡过夜，然后清洗步骤与上面相同。2、移液管用含洗洁精的自来水超声3次，每次半小时。 清洗标准： 玻璃透亮，内外壁水膜均匀、无油迹，无任何残留物质。 2 清洗步骤： 泡在有洗洁净的自来水中→用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→自来 水冲洗25次以上→过一遍一蒸水→泡入盐酸过夜→从酸中捞出后自来水冲洗 25遍→过三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前高温灭菌 （121℃， 20min） →烘干→使用 注意: 乳胶类器材由于常有滑石粉类成分，故应先用流水充分清洗。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 细胞冻存 冷冻保存要点 冷冻过程要缓慢： 4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →-80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存 或使用程序降温盒，每秒下降1 ℃ 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。 细胞浓度控制在：5x106－2x107/ml。 常用细胞冷冻保存液 5%或10％DMSO＋完全培养液 10％甘油＋完全培养液 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 1预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4 年后，存活率可达80％一90％。 DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。 细胞复苏 快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟） 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中 收到细胞的处理方式 (一) 1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到液氮)。  2. 冷冻细胞解冻程序: 2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。  2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。 2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T