优《血红蛋白的提取和分离》修正.ppt

; 本课题学习目标;1.分离生物大分子的基本思路：;（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）;3.凝胶色谱法的原理;4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程;凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示;（二）缓冲溶液; 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。;（三） 电 泳;影响蛋白质分子运动速度的因素;; 聚丙烯酰胺凝胶电泳; 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。;用SDS测定蛋白质分子量的方法; 二、实验操作;血液;血红蛋白;(1)红细胞的洗涤:;(2)血红蛋白的释放：;(3)分离血红蛋白溶液：;甲苯层（无色透明） ;(4)透 析：;透析过程动画演示;2.凝胶色谱操作:;（2）凝胶色谱柱的装填;③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 1、装填时尽量紧密：降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。; ;（3）样品加入与洗脱;（3）样品加入与洗脱;思考下面的问题：; 血红蛋白提取和分离的程序包括： 样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 样品的处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到血红蛋白溶液， 样品的粗分离:透析→去除分子量较小的杂质 样品的纯化：凝胶色谱法→除去相对分子质量较大 的杂质蛋白 纯度鉴定:聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。;（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）; 观察处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。 此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。;2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？;红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；说明凝胶色谱柱装填得很成???、分离操作也正确 红色区带：歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。