副溶血性弧菌检验标准操作程序.ppt

副溶血性弧菌检验标准操作程序 概　况 副溶血性弧菌于1950年从日 本一次暴发性食物中毒中分离 发现。该菌存在于近海的海水、 海底沉积物和鱼类、贝壳等海 产品中。在37℃、pH7.7、含 氯化钠3～4%的环境中生长最 好。主要引起食物中毒，尤以 日本、东南亚、美国及我国台 北地区多见，也是我国大陆沿 海地区食物中毒中最常见的一 种病原菌。 范　围 本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 本标准适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照使用。 食品种类 动物性水产品： 　鲜冻水产品（定性检测）：新鲜水产品和冷冻水产品； 　生食水产品（定性、定量检测）：新鲜的、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以直接食用的。 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他 设备和材料如下： ? 恒温培养箱：36 ℃±1℃。 ? 冰箱：2 ℃～5 ℃。 ? 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 ? 天平： 感量0.1 g。 ? 无菌试管：18 mm×180mm、15 mm×100 mm。 ? 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 ? 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 ? 无菌培养皿：直径90mm。 ? VITEK全自动微生物鉴定系统[1]。 ? 灭菌手术剪、镊子。 样品制备 ? 非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验； 冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻； 如果样品需要冷冻贮存，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），推荐贮存温度为-70 ℃以下。 样品制备 鱼类和头足 类动物取表 面组织、肠 或鳃。贝类 取全部内容 物，包括贝 肉和体液； 样品制备 样品制备 如为带壳贝类或 甲壳类，则应先在 符合生活饮用水卫 生标准的流水中洗 刷外壳并甩干表面 水分，然后以无菌 操作打开外壳，按 上述要求取相应部 分。 样品制备 　　　以无菌操作取检样25 g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min，或拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌容器内，加225 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。 增菌 定性检测 将上述1:10稀释液于36 ℃±1 ℃培养8 h～18 h。 增菌 定量检测 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。 另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h。 分离 在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 使用TCBS琼脂划线不可密集 分离 典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～3 mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈现为圆的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直径2 mm～3 mm。 TCBS琼脂上面的副溶血性弧菌 四种显色培养基 纯培养 挑取3个或 以上的可疑 菌落，划线 3％氯化钠 胰蛋白胨大 豆琼脂平板， 36 ℃±1 ℃ 培养18 h～ 24 h。 初步鉴定 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。 初步鉴定 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 初步鉴定 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3％氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。副溶血性弧菌在3％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。 TSA＋TTC可以方便观察副溶血性弧菌动力 初步鉴定 嗜盐性试验：挑取纯培 养的单个可疑菌落，分别 接种于不同氯化钠浓度的 胰胨水中，36℃±1℃培 养24h，观察液体混浊情 况。副溶血性弧菌在无氯 化钠和10％