第五章蛋白质结构解析.ppt

一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，K是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极A撞击而产生X射线。 1、样品制备 大量表达、分离和纯化目标蛋白 2、蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理 与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出 蛋白质晶体生长的影响因素 物理因素：温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等 化学因素：pH值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等 生化因素：蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和等电点等 蛋白质结晶方法 （1）批量结晶法（Batch crystallization） （2）透析法( Dialysis ) （3） 液相扩散法(Liquid diffusion) （4） 气相扩散法（Vapour diffusion） （5） 蛋白质结晶新方法 （1）批量结晶法（Batch crystallization） 通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。 （2）透析法( Dialysis ) 利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培养蛋白质晶体的常用方法。 （3） 液相扩散法(Liquid diffusion) 利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。 （4） 气相扩散法（Vapour diffusion） 把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。 3、衍射数据收集和处理 第三代同步辐射光源的应用使得用20-40 um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实 目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个： APS（USA）; ESRF（France）; SPring-8（Japan） 4、位相求解 1. 分子置换法(MR) 2. 多对同晶型置换法(MIR) 3. 多波长反常散射法(MAD) 分子置换法(MR) 分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法。 多对同晶型置换法(MIR) 在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如Pb和Hg等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。 多波长反常散射法(MAD) 利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。 5、模型建立和修正 晶体学R因子一般要求达到0.2以下 键长偏差大约为0.015? 键角偏差约为3° 二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制 核磁共振法中几个常用的参数 化学位移 耦合常数 NOE（核欧沃豪斯效应）信号强度 谱峰面积 弛豫时间 1.化学位移 δ 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；δ 值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。 3.NOE信号强度 当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应 （NOE）。 4.谱峰面积 谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。 5.弛豫时间 原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。 自旋晶格弛豫：处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。 自旋-自旋弛豫 ：两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。 核磁共振成像 基本原理：是将人体置于特殊的磁场中，用无线