污水中氯苯类化合物降解菌的筛选及降解特性的研究.docVIP

污水中氯苯类化合物降解菌的筛选及降解特性的研究 　　摘要：采用传统的方法进行分离、纯化、筛选、检测，得到氯苯类化合物的降解菌，对其降解率进行研究，并通过16S rRNA进行分离鉴定。结果表明，共筛选出4株具有降解活性的菌株，在18 ℃、pH 7.2时降解率较高。初步鉴定4株菌株分别为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、炭疽杆菌（B. anthraci）、同温层芽孢杆菌（B. stratosphericus）。 　　关键词：细菌；降解菌；降解率；氯苯类化合物 　　中图分类号：X703；Q814 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）02-0245-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.011 　　随着农业科技的发展，出于对防治农业害虫的需要，农药的使用也愈加普遍，有机氯农药使用量也更大，其主要成分为氯苯类化合物，一些染料厂、制药厂排放的污水中也含有氯苯类化合物。氯苯类化合物的残渣随着水土流失汇入河流湖泊，污染水源，由于它们中的大多数具有“三致”效应和难降解性，危害环境，更危害人类健康，因此被美国环保局（EPA）列为优先控制的污染物[1]。 　　氯苯类化合物化学性质较为稳定，在环境中普遍存在。目前针对污水中残存的氯苯类化合物，一些地区仍采用比较传统的方法处理污水，以及近年来采用氧化法、生物法以及活性污泥法等[2]，不仅成本高，而且处理流程繁琐。本研究采用微生物降解氯苯类化合物的方法，将会为氯苯类化合物的高效处理提供理论基础，现将报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试水样 分别从桂林市制药厂、染料厂、漓江、桃花江等水域采集水样，采集样品的深度为15～20 cm，样品间相距至少2 cm。 　　1.1.2 试剂与仪器 主要试剂有邻二氯苯、间二氯苯、石油醚等，均为分析纯，通用引物和PCR试剂盒由上海生工公司提供。主要仪器有干热灭菌器和高压灭菌器（上海申安医疗器械厂）、5424R低温高速离心机和TG-20高速离心机（武汉中科科仪技术发展有限公司）、漩涡振荡器（上海振荣科学有限公司）、OLYMPUS生物显微镜BX41-32FL和T100 PCR仪（Bio-Rad公司）、凝胶成像仪（上海培清科技有限公司）、旋转式摇床ZHWY-211C（上海智诚分析仪器制造有限公司）。 　　1.1.3 培养基 无机液体培养基：KNO3 0.1 g、微量元素液（KH2PO4 0.300 g、MgSO4?7H2O 0.300 g、FeSO4?7H2O 0.005 g、CaCl2 0.050 g溶于100 mL去离子水中）10 mL，加去离子水90 mL，pH 7.0～7.4，于121.3 ℃灭菌15 min。 　　有机液体培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，于121.3 ℃灭菌15 min。 　　有机固体斜面培养基：在液体培养基中，加入琼脂粉33 g/L，配制相应的有机固体培养基，制成试管斜面。 　　1.2 方法 　　1.2.1 菌株筛选 ①初筛：用移液管移取1 mL水样加入到盛有9 mL的无机液体培养基的试管中，同时加入邻二氯苯、间二氯苯各6 μL，于25 ℃、160 r/min的摇床里培养48 h。②复筛：48 h后将基础元素培养液移接到固体培养基中，恒温箱37 ℃培养24～48 h直至长出多个菌落，观察细菌长势。 　　1.2.2 分离纯化 ①在上述固体培养基中，挑选出不同菌落并作好标记。②将含单个菌落的平板中的菌落接种到固体培养基中，培养24～48 h，观察细菌生长情况，以此方法直至培养得到单个菌落的平板。将单个菌落的平板中一个菌落接种到固体斜面培养基上保存。③从斜面取菌接种到含有邻二氯苯和间二氯苯各10 μL，浓度为20 μL/10 mL的无机液体培养基中，于25 ℃、160 r/min的摇床里培养48 h。 　　1.2.3 降解率的测定 ①制备菌悬液挑取一环菌株，接种于含有12 μL/10 mL氯苯（邻二氯苯、间二氯苯各6 μL）有机液体培养基中，于25 ℃、160 r/min的摇床里培养24 h，3 500 r/min离心5 min，用无机液体培养基洗涤菌体3次，取部分菌体悬浮于无机液体养基中，配制一定浓度的菌悬液，备用。②从上述菌悬液中吸取1 mL接种在含氯苯化合物的无机液体培养基中，25 ℃分别培养24（第一次）、48、72 h（第二次）后分别用石油醚萃取，用紫外分光光度计（UV）（λ=221 nm）检测上清液中氯苯的含量。对照组为不含菌株含氯苯化合物的同样的无机液体培养基，采用与处理相