包涵体蛋白质复做性-纯化.pptVIP

大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融合蛋白的扩增，纯化和复性 E.g2: 过程 * 细胞培养 收获细胞 细胞破碎 离心 5 - 10 000g 沉淀物 冲洗和离心 分离包涵体 HiTrap? Chelating ＋ Ni2+ 纯化和复性 溶解 包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离 每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris? -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4oC下高速离心 10 分钟 重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在+4oC下高速离心 10 分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物 * 2 M UREA 20 mM Tris HCl 2% Triton X100 0.5 M NaCl 溶解和准备样品 重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液 (e.g.): 20 mM Tris? -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 * 在室温等 30-60 分钟 在+4oC 离心 15 分钟 用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜过滤 准备 HiTrap? Chelating 柱 冲洗 5 ml H2O 加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗 5 ml H2O 用 5-10 ml 20 mM Tr