实验四、体得外受精新.pptVIP

实验四、体外受精和蛙卵不同时期的切片的观察 附加内容：蛙胚不同时期切片观察 1.蛙卵单细胞 3.蛙胚分裂早期 4.蛙胚囊胚期 5.蛙胚原肠期 6.蛙胚神经板期 7.蛙胚神经沟期 8.蛙胚神经管期 9.3mm蛙胚 * * 体外受精技术不仅是探明受精机制的重要实验手段，而且也是为其它实验提供所需胚胎的重要技术. 通过本实验的学习，掌握体外受精原理和基本操作程序，并且能观察到哺乳动物早期胚胎的发育情况。 一、目的与意义 哺乳动物体内成熟或经过体外成熟的卵子，与获能的射出精子（家畜）或附睾尾精子在适宜的培养液中能够受精，并具有发育形成新的个体的能力； 本实验，采用常规的小鼠体外受精方法，即利用小鼠附睾尾精子和通过超排处理获得的卵子，利用改良的M16溶液，观察其体外受精过程。 二、实 验 原 理 受精过程： 精子穿越放射冠，与卵子发生特异性结合 精子穿越透明带和卵黄膜，进入卵细胞内 发生透明带反应和卵膜阻断，防止多精受精 原核形成，次级卵母细胞发生第二次成熟分裂，排出第二极体 最早尝试体外受精的是德国科学家Schenk 1951年Chang（美籍华人）和Austin 发现了精子的获能现象使体外受精成为可能 目前，在许多动物（人、家畜、实验动物）通过体外受精均获得了后代。 1978年7月25日，英国医学家罗伯特·爱德华和派屈克·斯蒂普托，用人卵母细胞体外受精和胚胎移植技术，制造了世界上第一例试管婴儿。这名试管婴儿叫路易斯·布朗。 体外受精的发展 试管婴儿 1978年7月25日，世界上第一例试管婴儿 —路易斯?布朗诞生。并在2007年成功生下一个男孩 罗伯特? 爱德华 帕克里特? 斯特普托 器械与仪器：二氧化碳培养箱、实体显微镜、加温板、血球计数板、滤纸、移卵管、微量移液器、35mm培养皿、实验动物手术器械等。 药品与培养液：PMSG、hCG、PB1、 M16液、 液体石蜡 实验动物：性成熟雄性和雌性小鼠 三、实验仪器与试剂药品 四、实验步骤 超数排卵：选择性成熟的雌性小鼠，间隔48h依次腹腔内注射各10单位PMSG和hCG； 1.实验动物的准备 ２. 精子悬浮液的制备 采用颈椎脱臼法处死雄性小鼠，采集附睾尾； 将附睾尾导入在培养皿内用培养液（M16）制成的培养滴中，并用眼科剪横断附睾尾； 当精子充分游出后，将附睾尾组织从操作液取出。将含有精子的培养滴作为精子悬浮液用于调制受精用精子液。 取精子悬浮液10μl并稀释10倍，采用红细胞计数法计测精子悬浮液中的精子密度； 计算加入培养液中精子悬浮液的量，调整培养液中的精子密度为5×105个/ml； 将含有调整好的精子液置于二氧化碳培养箱中预培养1～2h使精子获能。 ３.精子液的调制及预培养 4.卵丘卵子复合体的采集 雌性小鼠经超排处理，在注射hCG后第14～16h，采集输卵管并置于滤纸上； 将输卵管导入用液体石蜡封盖的受精用M16液培养滴旁的液体石蜡内。 4. 媒精 　　在实体显微镜下，用金属针或注射针撕破置于M16液培养滴旁液体石蜡内的输卵管膨大部，牵引其内的卵丘卵子复合体并导入含有预培养的精子液滴中进行媒精。然后置于二氧化碳培养箱中进行体外受精。 5.结果观察 根据需要，对获得的2-细胞期进行体外培养，观察发育至囊胚的能力。 媒精后，经30min、1.0h和1.5h依次观察颗粒细胞脱落状态； 根据需要，对获得的2-细胞期进行体外培养，观察发育至囊胚的能力。 有分裂沟 无分裂沟 2.二细胞蛙胚 囊胚早期 囊胚晚期 原肠早期-明显背唇，腹唇初现 原肠晚期-背腹唇和内卷明显 神经板 脊索