基因治疗-2017年10月.ppt

* 基因治疗 一.概念 基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。 一、 基因疗法是指将外源正常基因导入靶细胞，通过替代异常基因、封闭致病基因、剪去致病基因、修复受损基因和重建基因调控系统等，以纠正或补偿因基因缺陷和异常所引起的疾病，从而达到治疗的目的 全世界已获准的基因治疗临床试验方案达一千多项，其中，66%是针对癌症的治疗 二、基因治疗的必要条件 发病机制在DNA水平上已经清楚 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作 三.基因治疗方式 直接基因治疗和间接基因治疗 1、直接基因治疗(致病基因的原位置换)：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现） 基因敲出技术（gene knockout) 是指通过基因同源重组的过程定向的在活细胞中从基因组上移出特定基因的过程，从而建立基因剔除细胞和基因剔除生物 2、间接基因治疗： 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。 直接抑制有害基因的表达 基因增补：将目的基因导入病变细胞，并在细胞内表达，不需将缺陷基因替换出来，只要目的基因在细胞中能够表达，就达到了治疗的目的。这是目前基因治疗大多采用的方法，对单拷贝基因遗传病有效。如血友病。 基因干预(gene interference)： 指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。 基因干预 基因干预的种类： 反义RNA： 封闭基因表达 核酶： 裂解特异的靶mRNA RNA干涉技术： 反义RNA(antisense RNA):是指与mRNA互补的RNA分子,通常由15-20个核苷酸组成 。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合形成二聚体,从而阻止靶核酸的表达。 两种机制: 1.反义寡聚核苷酸可以激活RNaseH，该酶可以切割DNA·RNA杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解 2.反义寡聚核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译 靶RNA上的结合位点必须是暴露的 反义试剂必须被保护起来免遭核酸酶攻击 必须保证反义试剂能够被细胞摄取并在胞内正确定位 需克服技术问题: 2001，2002连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10大突破技术 RNA干涉 RNA干涉（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖。 RNA干涉机制: 外源dsRNA?进入细胞后可激活Dicer(多种核酸 酶、解螺旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶）,可以切割 双链RNA，双链RNA再与Dicer形成沉默复合物(RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干涉的过程。 2个步骤： （1）长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶(Dicer)切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA） （2）小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC），该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断 RNA干涉机制 目前RNA干扰技术主要应用于探查基因功能和探索治疗肿瘤或感染性疾病的可能性.初步的实验结果提示RNA干扰技术可用于治疗有异常基因的人肿瘤。用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。 将RNA干扰技术用于临床治疗人类疾病还有许多研究工作要做，如何将小干扰性RNA或能在细胞内生成小干扰性RNA样转录物的质粒DNA或病毒载体安全、有效地导入靶组织或靶细胞就是一个必须解决的问题。RNA干扰技术用于治疗人类疾病的安全性仍是个未知数。 四 、基因治疗的基本程序 目的基因的选择与获得 载体的选择 将目的基因克隆